تست MTT چیست؟ – به زبان ساده + روش و مراحل تست سمیت سلول

آنزیم‌های دهیدروژناز سلول‌های زنده نمک mtt را کاهش می‌دهد. تغییر ساختار این نمک منجر به تغییر رنگ آن از زرد به بنفش می‌شود. هر چه شدت رنگ ایجاد شده بیشتر باشد، تعداد سلول‌های زنده بیشتر است. به کمک این تست می‌توان غلظتی از ماده که منجر به مرگ سلول می‌شود را محاسبه کرد. در این مطلب از مجله فرادرس مراحل تست mtt و تفسیر آن را توضیح می‌دهیم.

تست MTT چیست؟

مراحل تست MTT

فیلم آموزش رنگ‌سنجی در آنالیز شیمیایی در فرادرس

کلیک کنید

پس از انتقال سلول به چاهک‌ها سلول با دارو یا ترکیب شیمیایی مورد نظر ترکیب می‌شود و حداقل ۲۴ ساعت در انکوباتور قرار می‌گیرد. پس از ۲۴ ساعت محیط کشت سلول‌ها با پیپت از چاهک‌ها خارج می‌شود و چاهک با اضافه کردن و بیرون کشیدن بافر فسفات شست و شو داده می‌شود. به هر چاهک ۲۰۰ میکرولیتر محیط کشت فاقد سرم همراه mtt اضافه می‌کنیم. غلظت نهایی mtt در هر چاهک باید ۵ میکروگرم بر میلی‌لیتر باشد. سپس پلیت به مدت ۴ تا ۶ ساعت در دمای ۳۷ درجه‌سانتی‌گراد در انکوباتور co2 قرار می‌گیرد.

پس از ۴ تا ۶ ساعت محلول چاهک‌ها به‌وسیله میکروپیپت آرام خارج می‌شود. در این مرحله چاهک را شست و شو نمی‌دهیم. شست و شو منجر به از بین رفتن نمک‌های فورمازون رسوب کرده در چاهک می‌شود. سپس ۱۰۰ میکرولیتر محلول DMSO (دی‌متیل سولفوکسید) به هر چاهک اضافه می‌شود. این محلول قطبی فورمازون را در خود حل می‌کند. در ادامه پلیت در فویل آلومینیومی پیچیده و ۱۵ دقیقه در دمای اتاق قرار می‌گیرد. یکبار پس از ۱۵ دقیقه و یکبار پس از ۶۰ دقیقه، جذب mtt در طول موج ۵۵۰ نانومتر اندازه گرفته می‌شود.

تفسیر تست MTT

در بخش‌های قبلی این مطلب از مجله فرادرس اساس و مراحل انجام تست mtt را بررسی کردیم. در این بخش نحوه تفسیر این تست را توضیح می‌دهیم. درصد سلول‌های زنده در هر غلظت ترکیب شیمیایی، پارامتر مهمی در mtt است که به کمک آن می‌توان میزان سمیت سلولی آن ترکیب را مشخص کرد. IC50 (غلظت مهاری | Inhibitory Concentration) و EC50 (غلظت موثر | Effective Concentration) دو پارامتر مهم دیگر در سنجش سمیت سلولی داروها است. EC50 غلظتی از دارو را نشان می‌دهد که ۵۰٪ پاسخ حداکثری را ایجاد می‌کند. IC50 غلظتی از دارو را نشان می‌دهد که منجر به مرگ ۵۰٪ سلول‌ها می‌شود. IC50 برای ترکیبات شیمیایی استفاده می‌شود که یک مسیر بیوشیمیایی در سلول را مهار می‌کنند و درصد زنده‌مانی سلول‌ها را کاهش می‌دهند. EC50 برای ترکیبات شیمیایی استفاده می‌شود که فعالیت یک مسیر بیوشیمیایی و درصد زنده‌مانی سلول‌ها را افزایش می‌دهند. این دو کمیت را می‌توان از نمودار درصد سلول‌های زنده یا سلول‌های مرده برحسب غلظت دارو تعیین کرد.

درصد سلول‌های زنده را می‌توان با معادله زیر محاسبه کرد. در این معادله $$A_{exp}$$ جذب mtt در غلظت‌های متفاوت نمونه، $$A_{neg}$$ میانگین جذب کنترل منفی و $$A_{pos}$$ میانگین جذب کنترل مثبت است.

$$\frac{{A_{exp}}-A_{neg}}{A_{pos}}\times 100$$

رسم نمودار IC50 و EC50

از گزینه insert در نوار ابزار بالای صفحه chart و از chart رسم نمودار scatter را انتخاب می‌کنیم. نرم‌افزار نمودار را رسم می‌کند.

با کلیک روی نمودار از پنجره باز شده Add Trendline را انتخاب می‌کنیم. با کلیک بر نمودار رسم شده گزینه‌های set intercept، display equation on chart و display R-square on chart را فعال می‌کنیم.

در معادله خط ایجاد شده y (درصد سلول‌های زنده) را ۵۰ قرار می‌دهیم و مقدار x (غلظت ترکیب شیمیایی) را محاسبه می‌کنیم. به این ترتیب IC50 را بدست می‌آوریم. برای محاسبه EC50 می‌توان از همین روش استفاده کرد. IC50 برای نمودارهای نزولی و EC50 برای نمودارهای صعودی محاسبه می‌شود.

به جای MTT از چه روش‌هایی می‌توان استفاده کرد؟

mtt کاربردی‌ترین تست تشخیص سمیت سلولی است. اما زمانی که انجام این تست امکان‌پذیر نیست می‌توان از روش‌های جایگزین XTT، WST، SRB، MTS، رنگ‌آمیزی مرده-زنده (live-dead assay) و سنجش ATP استفاده کرد.

فیلم آموزش زیست‌ شناسی سلولی در فرادرس

کلیک کنید

• تست MTS: معرف این تست نمک ۳-(دی‌متیل تیازول-۲-ایل)-۵-(۳-کاربوکسی‌متوکسی فنیل)-۲-(۴-سولفوفنیل)-۲هیدروژن-تترازولیوم است. از کاهش این نمک به‌وسیله آنزیم‌های ردوکتاز میتوکندری نمک‌های فورمازان محلول در آب تولید می‌شود. مراحل انجام این تست شبیه mtt است. اما مرحله حل کردن نمک‌های فورمازان حذف می‌شود. در نتیجه تست سریع‌تر از mtt انجام می‌شود و نتایج دقیق‌تری دارد.
• تست WST: معرف تست WST مثل mtt و MTS نمک تیازولوم است.معرف این روش از نمک ۲-(متوکسی-۴-نیتروفنیل)-۳-(۴-نیتروفنیل)-۵-(۲،۴-دی‌سولفو فنیل)-۲-هیدروژن-تترازولیوم است که از کاهش آن به‌وسیله آنزیم‌های هیدروژناز سیتوپلاسم فورمازان محلول و نارنجی تولید می‌شود. هزینه این روش از mtt بیشتر است. رنگ نارنجی ایجاد شده شبیه رنگ فنول رد (phenol red) است. به همین دلیل بهتر است از این روش برای محیط‌های فنول رد استفاده نشود.
• SRB: معرف روش SRB رنگ سولفورودامین بی (Sulforhodamine B) است. این رنگ از دو گروه سولفونیک تشکیل شده است که در محیط‌های اسیدی ضعیف به آمینواسیدهای پروتئين سلولی متصل و در محیط‌های بازی جدا می‌شود. رنگ SRB صورتی کم‌رنگ است.
• رنگ‌آمیزی مرده-زنده: در روش رنگ‌آمیزی مرده-زنده از دو رنگ فلورسنت برای رنگ‌آمیزی هسته سلول‌های زنده و مرده استفاده می‌شود. در این روش سلول‌های زنده رنگ آبی و سلول‌های مرده رنگ سبز منتشر می‌کنند. سلول‌ها پس از رنگ‌آمیزی زیر میکروسکوپ فلورسنت بررسی و تعداد سلول‌ها بر اساس شدت نور محاسبه می‌شود.
• سنجش ATP: تست سنجش ATP بر این اساس طراحی شده است که سلول‌های مرده ATP تولید نمی‌کنند و مولکول‌های ATP بلافاصله پس از مرگ سلول به‌وسیله آنزیم ATPas تجزیه می‌شود. در این تست از آنزیم لوسیفراز کرم شب‌تاب و لوسیفرین استفاده می‌شود. لوسیفراز با مصرف ATP لوسیفرین را به اوکسیلوسفرین تبدیل می‌کند. این واکنش با فوتون‌های نوری در طول موج ۵۵۰ تا ۵۷۰ نانومتر (سبز تا زرد) همراه است. برای سنجش ATP سلول‌های زنده لیز و ATPase مهار می‌شود. هر چه غلظت ATP در محیط کشت بیشتر باشد، شدت نور ایجاد شده و درصد سلول‌های زنده بیشتر است.

سوالات متداول

در این بخش از مطلب مجله فرادرس به تعدادی از سوالات متداول پیرامون تست mtt پاسخ می‌دهیم.

تست MTT مخفف چیست؟

در تست MTT از واکنش کاهش نمک ۳-(۴،۵-دی‌متیل تیازول-۲-یل)-۲،۵دی‌فنیل تترازولیوم برومید برای تشخیص فعالیت سلول استفاده می‌شود. MTT مخفف نام این نمک است. حرف m نشانه متیل، اولین حرف t نشانه تیازولیل و دومین حرف t نشانه تترازولیوم است.

در چه مواردی نمی‌توان از تست MTT استفاده کرد؟

تست MTT روشی کم‌هزینه، سریع و راحت برای بررسی سمیت سلولی ترکیبات شیمیایی و زیستی است. اما استفاده از آن محدودیت‌هایی دارد. از این تست نمی‌توان برای ترکیباتی که متابولیسم سلول‌ها را تغییر می‌دهند استفاده کرد. نمک MTT در بعضی از سلول‌ها سمیت ایجاد می‌کند و سمیت سلولی ماده مورد آزمایش را افزایش می‌دهد. از سلول‌هایی تست MTT برای آن‌ها انجام شده است نمی‌توان در ادامه آزمایش استفاده کرد. به همین دلیل در مواردی که تعداد سلول‌های محیط کشت کم است این روش پیشنهاد نمی‌شود.