فرادرس
فلاسک کشت سلول چیست؟ – هر آنچه باید بدانید
کشت سلول یکی از مراحل مهم تحقیقات آزمایشگاهی (in vitro) سلول‌ها است. به کمک روشهای کشت سلول می‌توان موفولوژی سلول‌ها، سرعت تقسیم آن‌ها، پاسخ آن‌ها به تغییرات محیطی و فیزیولوژیک (دارو یا جهش ژنتیکی) را بررسی کرد. فلاسک کشت سلولی یکی از ابزارهای اصلی مورد نیاز برای کشت سلول‌ها است. در این مطلب انواع فلاسک کشت سلول، معیارهای انتخاب فلاسک متناسب با نوع سلول و شیوه تغییر فلاسک در فریند کشت را توضیح می‌دهیم.
فلاسک کشت سلول چیست ؟
فلاسک کشت سلول یکی از ابزارهای آزمایشگاه زیستشناسی است. این ابزار از شیشه یا پلیمرهای (پلیاستیرن) خنثی ساخته میشود تا محیط مناسبی برای رشد انواع سلولهای پروکاریوت و یوکاریوت ایجاد کند. کشت سلولی یکی از مراحل اولیه در انجام بسیاری از پروژه‌های تحقیقاتی بر سلولهای جانوری برای بررسی آنزیم‌ها، اسیدهای نوکلئوئیک، آنتی‌بادی‌ها و مسیرهای بیوشیمیایی است. به علاوه بسیاری از تست‌های تشخیصی در آزمایشگاه‌های میکروب‌شناسی بر اساس کشت باکتری و آنالیز کلونی‌های تشکیل شده از یک نمونه انجام میشود. به همین دلیل انتخاب فلاسک یا پلیت کشت مناسب برای راحتی کاربر، دستیابی به تعداد مناسب سلول و کمترین میزان آلودگی سلول‌ها بسیار اهمیت دارد.
انواع فلاسک کشت سلول
ظرف‌های کشت سلول را می‌توان بر اساس نوع سلول باکتری، جانوری و گیاهی، هدف کشت سلول، تعداد سلولهای مورد نیاز پس از کشت، نوع محیط کشت و چسبندگی یا معلق بودن سلول، به انواع مختلفی تقسیم کرد. فلاسک مسطح، فلاسک اسپینر و فلاسکهای ارلن مایر انواع متدوال این ابزارهای کشت سلولی هستند که در اندازه‌های متفاوت تولید می‌شوند. سطح داخلی این فلاسک‌ها بر اساس نیاز شما به‌وسیله مولکول‌های زیستی (ازجمله کلاژن) یا شیمیایی پوشیده میشود.
فلاسک کشت سلول مسطح
این فلاسک‌ها یکی از متدوال‌ترین انواع ظرف کشت سلولهای جانوری هستند. در طراحی این فلاسک‌ها گردنی در نظر گرفته شده است که به شما این امکان را می‌دهد به راحتی محیط کشت را به فلاسک انتقال دهید. شکل این فلاسک‌ها شبیه حرف انگلیسی است به همین دلیل با توجه به حجم محیط کشتی که در خود جای می‌دهند به انواع T25، T75، T175، T225 و T300 تقسیم می‌شوند. تقسیم‌بندی این فلاسک‌ها بر اساس مساحت سطح دسترس برای کشت سلول است. برای مثال مساحت در دسترس برای کشت سلول در فلاسکهای تی ۲۵، ۲۵ سانتی‌متر مربع ($$cm^2$$) است. فلاسکهای T، پرکاربردترین فلاسکهای کشت سلولهای جانوری هستند. بر اساس نوع سلول و سرعت تکثیر آن می‌توان از فلاسکهای مختلف استفاده کرد. برای مثال حداکثر تعداد سلولهای Hela در این فلاسک‌ها در ادامه آمده است.
- فلاسک T25: حدود ۲،۸۰۰،۰۰۰ سلول
- فلاسک T75: حدود ۸،۴۰۰،۰۰۰ سلول
- فلاسک T175: حدود ۲۳،۳۰۰،۰۰۰ سلول
- فلاسک T225: حدود ۳۰۰،۰۰۰،۰۰۰ سلول
فلاسک کشت سلول چند لایه
فلاسکهای چندلایه از به دو نوع مسطح و دایره‌ای تقسیم می‌شوند. شکل فلاسکهای چندلایه مسطح با فلاسکهای تک‌لایه تفاوتی ندارد. اما فضای اصلی آن‌ها به چند بخش مختلف تقسیم میشود که مساحت در دسترس برای کشت سلول را افزایش می‌دهد. برای مثال اگر در یک فلاسک تک‌لایه ۷۵ میلی‌لیتر محیطی کشت برای کشت ۵۰ سلول استفاده می‌کنید. این حجم در فلاسکهای ۵ لایه به ۱۰ میلی‌لیتر در هر سطح تبدیل میشود. با استفاده از این فلاسک می‌توانی همزمان چند نمونه سلولی را در یک ظرف کشت دهید.
اسپینر
این فلاسک‌ها بخشی از سیستم‌های بیوراکتوری هستند که برای کشت سلول‌ها در محیط مایع از آن‌ها استفاده میشود. فلاسک اسپینر ظرفی استوانه‌ای از جنس شیشه یا پلیمرهای خنثی است که در دو طرف لوله‌های اتصالی به بخش اصلی دستگاه قرار دارد. این فلاسک‌ها بیشتر برای کشت سلول‌ها در مقیاس صنعتی استفاده میشود و حجم آن‌ها بین ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ میلی‌لیتر محیطی است.
فلاسک کشت سلول با دیواره متحرک
خارج کردن سلولهای بنیادی، استخوانی و بافت‌ها از فلاسکهای کشت معمولی دشوار است و ممکن است با آسیب بافت کشت شده همراه باشد. همچنین استفاده از پتری‌دیش یا پلیت‌های بدون در، احتمال آلودگی‌های محیطی را افزایش می‌دهد. این فلاسک‌ها برای دسترسی راحت به سلول کشت شده طراحی شده‌اند. این فلاسک‌ها شبیه فلاسکهای مسطح هستند با این تفاوت که یکی از دیواره‌های آن را می‌توان جدا کرد. این فلاسک‌ها در کشت بافت و داربست‌های سلولی کاربرد فراوانی دارند و پس از تشکیل داربست یا کامل شدن رشد بافت می‌توان با برداشت دیواره سلیفونی به راحتی و بدون آسیب فیزیکی بافت را خارج کرد.
فلاسک کشت سلول اتوماتیک
در کشت سلولی اتوماتیک بخشی یا همه فرایندهای کشت سلول به‌وسیله دستگاه‌های اتومات و برنامه‌ریزی شده انجام میشود. به همین دلیل اندازه و شکل فلاسکهای این نوع کشت متناسب با مهندسی دستگاه تغییر کرده است. فلاسک کشت سلولی که در این روش استفاده میشود معمولا مستطیلی با قطر بسیار کمتر از فلاسکهای مسطح است. به علاوه برآمدگی فلاسکهای مسطح در این ظرف‌ها حذف شده است.
پتری دیش
برای کشت سلولهای باکتریایی معمولا از پتری‌دیش یا لوله‌های آزمایش استفاده میشود. پتری‌دیش ظرفی دایره‌ای از جنس شیشه یا پلیمرهای خنثی است که می‌توان آن را در انکوباتورهای کشت سلولی قرار داد. از این ظرف‌ها می‌توان برای محیط کشت‌های جامد استفاده کرد. لوله آزمایش یکی از پرکاربردترین ابزارهای آزمایشگاه زیست و شیمی است که بیشتر برای محیط کشت‌های مایع و نیمه‌جامد باکتری از آن استفاده میشود.
انواع پوشش سر فلاسک کدام است ؟
دو نوع پوشش سر یا کَپ در فلاسکهای کشت سلولی وجود دارد. کَپ مهروموم و بدون منفذ برای روشهای کشت سلولی است که محیط کشت باید کاملا از محیط اطراف جدا باشد. پوشش سر منفذدار را می‌توان برای کشت سلول‌هایی استفاده کرد که به اکسیژن بیشتر محیط نیاز دارند. منفذ این درها با فیلتری سیار نازک به قطر ۲ میکرومتر پوشیده شده است تا از ورود آلودگی‌های محیطی جلوگیری کند.
انتخاب فلاسک مناسب برای کشت سلول
در بسیاری از پروژه‌های تحقیقاتی از سلولهای رده پستانداران استفاده میشود. اولین مرحله کشت این سلول‌ها جدا کردن سلول و آماده‌سازی نمونه جانوری است. با توجه به نوع سلول روشهای آماده‌سازی آن متفاوت است. برای مثال سلولهای خونی را می‌توان به راحتی از خون جدا و کشت کرد. اما ماتریکس بافت استخوانی جدا شده از بدن باید قبل از کشت به‌وسیله آنزیم‌های هیدرولازی (کلاژناز، تیریپسین و پروناز) تجزیه و سلولهای استخوانی جدا شوند. به علاوه سلولهای خونی برای رشد و تکثیر نیاز به اتصال به یک سطح مشخص ندارند.
به همین دلیل می‌توان از محیطی کشت مایع و فلاسکهای بدون پوشش‌دیواره برای کشت آن‌ها استفاده کرد. اما سلولهای بافت نرم و سخت مثل استخوان نیاز به یک سطح مشخص (معمولا پوشیده شده از کلاژن‌ها و لامین‌های ماتریکس خارج سلولی) برای تکثیر و رشد دارند. به سلولهای خونی، سلولهای معلق و به سلولهای استخوانی، سلولهای چسبنده گفته میشود.
فلاسکهای پوشش‌دار شده با پلی-L-لیزین و کلاژن نوع I اجمله فلاسکهای مناسب برای سلولهای چسبنده هستند. از این فلاسک‌ها می‌توانید برای کشت سلولهای اولیه که اتصال خوبی به ماترکیس‌های دیگر ندارند یا رشد آن‌ها حتی پس از تغییر شرایط محیط کشت کند است، استفاده کنید. این فلاسک‌ها بستر بسیار مناسبی برای اتصال، رشد و تمایز سلولهای چسبنده ایجاد می‌کنند.
علاوه بر ویژگی چسبندگی و سطح مناسب، نوع سرپوش در انتخاب فلاسک مناسب مهم است. بهتر است از فلاسک‌هایی برای کشت سلول استفاده کنید که سرپوش آن‌ها به راحتی و با پیچش یک دست باز می‌شوند و از ایجاد آلودگی جلوگیری می‌کنند.
آماده سازی فلاسک کشت سلول
پس از انتخاب فلاسک مناسب با توجه به نوع سلول و نوع محیط کشت مناسب آن، برای جلوگیری از هر گونه آلودگی احتمالی محیط کشت استریل را به وسیله پپیت استریل با حجم مناسب و زیر هود لامینار به فلاسک اضافه کنید. اما چه مقدار محیط کشت برای هر فلاسک مناسب است؟ حجم کامل هر فلاسک را می‌توان از حاصلضرب مساحت سطح دیواره در فاصله بین دو دیواره محاسبه کرد. اما برای کشت سلولی نیاز نیست تمام فلاسک را پر کنید. فقط کافیست حجمی از محیط کشت به فلاسک اضافه کنید که بین ۰٫۲ تا ۰٫۵ سانتی‌متر از ارتفاع آن را پر می‌کند.
تغییر فلاسک کشت و شمارش سلول ها
سلولهای اولیه کشت شده در فلاسک پس از چند هفته تکثیر، تمام سطح در دسترس برای کشت را پر می‌کنند. د این حالت مواد غذایی لازم برای تعداد سلول‌ها کافی نیست. در نتیجه ممکن است شکل ظاهری سلول‌ها (فنوتیپ) تغییر کند یا همه سلول‌ها آپوپتوز کنند. به همین دلیل برای رسیدن به سلولهای سالم بیشتر نیاز است که سلول‌ها را به فلاسک دیگری منتقل کنیم. به این فرایند پاساژ سلول یا بافت گفته میشود.
برای بررسی تراکم سلولهای چسبنده در فلاسک در کافی است با توجه به ویژگی‌های رده سلولی در بازه‌های زمانی مشخص، فلاسک را زیر میکروسکوپ فاز معکوس بررسی کنید تا قبل از تغییر شکل یا مرگ، سلول‌ها را به محیط کشت جدید انتقال دهید. برای بررسی غلظت مواد غذایی در محیط کشت می‌توانید pH محیط را اندازه‌گیری کنید. کاهش pH محیط کشت نشان‌دهنده افزایش لاکتیک‌اسید متابولیسم سلول در محیط است. در این شراتیط به دلیل کمبود گلوکز سلول‌ها از تنفس بی‌هوازی برای تولید ATP مورد نیاز خود استفاده می‌کنند. اگر pH محیط کشت ناگهان و همزمان با افزایش تراکم سلول‌ها بیش از ۰٫۱ تا ۰٫۲ واحد تغییر کرد، بهتر است محیط کشت سلول‌ها را با محیط کشت تازه تغییر دهید.
برای تعویض فلاسک و محیط کشت سلولهای چسبنده را می‌توان با روشهای فیزیکی یا آنزیمی از سطح فلاسک جدا کرد.
- روشهای فیزیکی: این روش را می‌توان برای رده‌های سلولی به کار برد که اتصال ضعیفی با سطح دارند. در این روش با تکان دادن آهسته فلاسک یا پپیت کردن سریعه محیط کشت می‌توان سلول‌ها را به‌راحتی از کف فلاسک جدا کرد. همچنین می‌توان از اسکراپرهای مخصوص کشت سلولی برای جدا کردن سلول‌ها استفاده کرد. سلولهای حساس ممکن است در این روش آسیب ببینند.
- روشهای آنزیمی: تریپسین، کلاژناز و دیسپاز سه پروتئاز پرکاربردی هستند که برای جدا کردن سلولهای چسبنده از سطح فلاسک کشت استفاده می‌شوند. از ترکیب تریپسن و کلاژناز برای جدا کردن سلولهای بسیار متراکم و چندلایه مثل فیبروبلاست‌ها بهره می‌برند. از دیسپاز می‌توان برای جدا کردن کامل سلولهای اپیدرمی بدون آسیب به یکپارچگی صفحه سلولی ایجاد شده استفاده کرد.
شمارش سلولهای کشت شده یکی از روشهای ارزیابی سلامت سلول‌ها، اطمینان از صحت مراحل کشت و تعیین زمان تغییر فلاسک کشت سلول است. تعداد سلولهای موجود در فلاسک را می‌توان با استفاده از روش قدیمی لام هموسیتومتر یا دستگاه‌های سلول شمار اندازه‌گیری کرد. در بسیاری از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی از لام‌های هموسیتومتر و رنگ متیلن‌بلو برای شمارش سلولهای معلق و چسبیده استفاده می‌کنند. آماده‌سازی سلولهای معلق و چسبنده از دو روش انجام میشود.
- برای شمارش سلولهای معلق نیازی به جداسازی سلول ندارید و به راحتی می‌توانید با یک پیپت مناسب حجم مشخصی از سلول‌ها و محیط کشت را روی لام هموسیتومتر قرار دهید. قبل از برداشت سلول‌ها با تکان دادن فلاسک کشت، نمونه را یک‌نواخت کنید.
- اما برای سلولهای چسبنده ابتدا باید سلول را به‌وسیله ترییپسین از سطح فلاسک جدا کنید. برای این کار ابتدا محیط کشت را به‌وسیله پیپت از فلاسک خارج کنید. سلول‌ها را با محلول بافر فسفات شست و شو دهید. تریپسین همراه با EDTA را به محیط اضافه و برای چند دقیقه انکوبه کنید. تریپسین را از محیط خارج کرده و سلول‌ها را با بافر فسفات شست و شو دهید. با اضافه کردن محیط کشت، سلول‌ها را دوباره معلق و سانتریفیوژ کنید. رسوب ته‌نشین شده در لوله آزمایش را با همان حجم اولیه محیط کشت معلق کنید. مقداری محیط کشت را پس از مخلوط کردن با تریپان بلو روی لام هموسیتومتر استریل بریزید.
برای شمارش سلول‌ها لام هموسیتومتر را زیر میکروسکوپ قرار دهید و تعداد سلول در چهار مربع اصلی (سلولهای داخل مربع، ضلع راست و ضلع پایینی) را بشمارید. برای محاسبه کل سلول‌ها کافی است میانگین سلولهای شمارش شده را در حجم اولیه و میزان رقیق‌سازی ضرب کنید.
