PCR چیست؟ | هر آنچه باید بدانید

«واکنش زنجیره‌ای پلیمراز» (Polymerase Chain Reaction | PCR)، یک تکنیک رایج آزمایشگاهی است که در تکثیر قطعه مشخصی از DNA به کار می‌رود. هیچ محدودیتی در انتخاب قطعه مورد نظر وجود ندارد و ممکن است حاوی تمام یا بخشی از ژن‌های رمزکننده پروتئين‌، RNA یا بخشی از یک مارکر زیستی باشد که در پزشکی قانونی برای احراز هویت به کار گرفته می‌شود.

به طور کلی،‌ هدف از PCR فراهم کردن تعداد کپی‌های فراوان از ناحیه مورد نظر است. این کپی‌ها در گام بعد،‌ برای بررسی و تحلیل ویژگی‌ها یا انجام مراحل مختلف کلونینگ و موارد گوناگون دیگر مصرف می‌شوند. تعیین توالی، انتقال به ژل الکتروفورز و درج در پلاسمید، مثال‌هایی از این دست هستند.

به سادگی می‌توان حدس زد که PCR در عرصه‌های مختلف علوم زیستی، از اهمیت و کاربرد بالایی برخوردار است. برخی از این حوزه‌ها عبارتند از:

• زیست‌شناسی مولکولی
• تشخیص پزشکی
• شاخه‌هایی از اکولوژی

اجزای PCR

آنزیم «Taq پلیمراز»، پرایمرها، DNA الگو و نوکلئوتیدها - واحدهای ساختاری DNA -  اجزای کلیدی یک واکنش PCR به شمار می‌روند. این اجزا، همراه با کوفاکتورهای مورد نیاز آنزیم، در یک تیوب کوچک، جمع می‌شوند و سپس، یک چرخه متناوب از گرمایش و سرمایش، بارها و بارها تکرار می‌شود تا سرانجام، میلیون‌ها نسخه از DNA مورد نظر ساخته شود.

Taq پلیمراز

واکنش PCR نیز مانند فرایند «همانندسازی DNA» به آنزیم DNA پلیمراز وابسته است. این آنزیم، فرایند ساخته شدن رشته جدید را از روی رشته قدیمی (الگو) کاتالیز می‌کند. آنزیم DNA پلیمرازی که معمولا در واکنش PCR به کار گرفته می‌شود، Taq پلیمراز نام دارد. این آنزیم از یک باکتری مقاوم به گرما به نام «ترموس آکواتیکوس» (Thermus aquaticus) گرفته شده است.

فیلم آموزش واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR و طراحی پرایمر در فرادرس

کلیک کنید

باکتری ت. آکواتیکوس در چشمه‌های آب داغ و دریچه‌های گرمابی زندگی می‌کند. این دریچه‌ها در بستر دریا و اقیانوس، در نزدیکی مکان‌های فعال آتشفشانی قرار دارند و محل خروج هوای گرم هستند. بنابراین می‌توان حدس زد که آنزیم‌های مختلف این باکتری، از جمله DNA پلیمراز، نسبت به گرما بسیار مقاوم هستند. به طوری که این آنزیم،‌ در دمای 70 درجه سانتیگراد، در فعال‌ترین حالت خود قرار دارد، دمایی که در آن، بیشتر آنزیم‌های انسانی، غیرفعال خواهند شد.

پیش از آن که جزئیات بیشتری را در مورد Taq پلیمراز بررسی کنیم، می‌بایست با سه اصطلاح علمی در حوزه آنزیم‌ها آشنا شویم.

• «پایداری گرمایی» (Heat-Stability): توانایی آنزیم در حفظ ساختار سه‌بعدی و عملکرد خود در دماهای بالاتر از محیط مناسب خود.
• «قدرت پردازش» (Processivity): توانایی آنزیم در حفظ اتصال به سوبسترا تا پایان واکنش. بالاتر بودن قدرت پردازش، به معنای آن است که آنزیم می‌تواند تعداد بیشتری واکنش را تا مرحله نهایی به پیش ببرد و پیش از آن که واکنش به پایان برسد،‌ سوبسترا را رها نخواهد کرد.
• «صحت عملکرد» (Fidelity): توانایی اتصال مولکول صحیح، در جای صحیح. در مورد پلیمرازها، این ویژگی، به معنای آن است که در مقابل هر نوکلئوتید، مولکول مکمل آن قرار خواهد گرفت. همانطور که مشخص است، این ویژگی در PCR دارای اهمیت فراوانی است چراکه هرگونه اشتباه در جایگذاری نوکلئوتیدها، به تغییرات قابل توجهی در نتیجه نهایی آزمایش می‌انجامد.

پایداری گرمایی،‌ Taq پلیمراز را به یک آنزیم ایده‌آل برای PCR تبدیل می‌کند چراکه در این واکنش، دمای محیط، بارها و بارها افزایش می‌یابد تا رشته‌های الگو از یکدیگر باز شوند و دوباره واکنش تکثیر از سر گرفته شود. در واقع، دمای حدود 72 درجه سانتیگراد، نه تنها موجب کاهش فعالیت Taq پلیمراز نمی‌شود، بلکه آن را به طور چشمگیری افزایش خواهد داد. در دماهای حدود 90 درجه سانتیگراد یا بالاتر از آن، اگرچه آنزیم، عملا فعالیت قایل توجهی نخواهد داشت، اما ساختار خود را حفظ می‌کند و در صورت کاهش دما، دوباره به فرم فعال خود برمی‌گردد. به جدول زیر که بازده این آنزیم در دماهای مختلف را نشان می‌دهد،‌ توجه کنید.

نکته قابل توجه دیگر در مورد این آنزیم، قدرت پردازش آن است. به طور کلی، Taq پلیمرازهای پرکاربرد در آزمایشگاه‌ می‌توانند تکثیر قطعاتی به طول حداکثر 3000 نوکلئوتید را به انجام برسانند. با اندکی تغییر در شرایط، می‌توان این عدد را تا 4000 نوکلئوتید نیز افزایش داد. امروزه، فرم‌های تغییریافته‌ای از پلیمراز نیز در آزمایشگاه‌ها به کار گرفته می‌شوند که برای تکثیر قطعات بلندتر (حدود $$30 kb$$) بهینه شده‌اند.

ویژگی دیگر، «صحت عملکرد» است که بازتابی از «وفاداری به الگو» و قدرت «ویرایش خطا» (Proofing) را نشان می‌دهد. در مورد Taq پلیمرازهای رایج، این ویژگی با عدد $$2.7-3.0\times10^{-4}$$ نشان داده می‌شود که گویای جایگذاری یک نوکلئوتید غلط، به ازای هر 3000 باز است.

پرایمرهای PCR

آنزیم Taq پلیمراز نیز، مانند پلیمرازهای دیگر، تنها در صورتی می‌تواند سنتز رشته جدید را کاتالیز کند که مولکول «پرایمر» را در اختیار داشته باشد. پرایمر، در واقع،‌ مولکول نوکلئوتیدی کوچکی است که یک نقطه آغاز را در اختیار آنزیم قرار می‌دهد. این نقطه آغاز، همان گروه هیدروکسیل آزاد موجود در انتهای $$3'$$ آخرین نوکلئوتید مولکول پرایمر است.

پرایمرهای مورد استفاده در واکنش زنجیره‌ ای پلیمراز قطعه‌های کوتاهی از یک DNA تک-رشته‌ای هستند که معمولا حدود 20 نوکلئوتید طول دارند. این قطعه‌ها طوری طراحی می‌شوند که «ناحیه هدف» (Target Region) را در بر بگیرند. منظور از این ناحیه، بخشی از DNA است که طی واکنش PCR تکثیر خواهد شد. به این ترتیب، برای هر واکنش PCR، دو مولکول پرایمر نیاز داریم که می‌بایست، هریک، به یکی از دو رشته DNA متصل شوند و ناحیه هدف را احاطه کنند. این اتصال، ‌از طریق پیوندهای هیدروژنی بین پرایمر و الگو صورت می‌گیرد.

پس از اتصال پرایمرها به الگو، رشته جدید، با کمک آنزیم پلیمراز، ساخته خواهد شد. می‌دانیم که در هر قطعه از ژنوم انسان، تنها یکی از دو رشته DNA، حاوی ژن رمزکننده و فعال هستند. پرایمری که برای اتصال به این رشته طراحی می‌شود، «پیشرو» (Forward) و پرایمری که برای اتصال به رشته مکمل طراحی می‌شود، «معکوس» (Reverse) نام دارد. پرایمرهای پیشرو و معکوس، به ترتیب با حروف اختصاری «F» و «R» نشان داده می‌شوند. در تصویر بالا، رشته پایینی DNA، حاوی ژن هدف است.

بافر PCR

همانطور که می‌دانیم، هر آنزیم در یک شرایط اسیدی و یونی خاص، بیشترین فعالیت را نشان می‌دهد. بافرها این شرایط را ایجاد و تا پایان واکنش، حفظ می‌کنند. در مورد Taq پلیمراز، بیشتر این بافرها حاوی تریس-$$HCl $$،‌ نمک کلرید پتاسیم ($$KCl$$) و گاهی نمک $$MgCl_2$$ هستند.  تریس-$$HCl $$ به حفظ pH بین 8 تا 9/5 کمک می‌کند. یون پتاسیم موجود در این بافرها، موجب تقویت فرایند اتصال پرایمرها به الگو،‌ طی مرحله آنیلینگ می‌شود و یون منیزیم، به عنوان کوفاکتور آنزیم پلیمراز، به آن متصل خواهد شد تا آن را به فعال‌ترین حالت ساختاری خود در آورد. بافرهای PCR، معمولا در غلظت‌ $$10X$$ به فروش می‌رسند.

مراحل PCR

مراحل اصلی واکنش PCR عبارتند از:

• «واسرشتگی» (Denaturation)
• «اتصال» (Annealing)
• «گسترش» (Extension)

فیلم آموزش واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR و طراحی پرایمر در فرادرس

کلیک کنید

واسرشتگی

واسرشتگی در دمای 96 درجه سانتیگراد رخ می‌دهد و طی آن،‌ افزایش دمای محیط، موجب باز شدن دو رشته الگو از یکدیگر می‌شود. این فرایند را دناتوراسیون یا واسرشتگی می‌نامیم. مولکول‌های تک-رشته‌ای حاصل،‌ در گام بعد، به عنوان الگو به کار گرفته می‌شوند.

اتصال

اتصال معمولا در بازه دمایی بین 55 تا 65 درجه سانتیگراد رخ می‌دهد و طی آن، با کاهش دمای محیط، شرایط برای اتصال پرایمرها به توالی‌های مکمل خود فراهم می‌شود. پرایمرها‌ در جهت $$5'\rightarrow3'$$ خود و $$3'\rightarrow5'$$ رشته الگو به آن متصل می‌شوند. به این ترتیب،‌ سر $$3' $$ آن‌ها که حاوی گروه هیدروکسیل آزاد است،‌ در اختیار آنزیم پلیمراز قرار می‌گیرد تا همانندسازی DNA را در ناحیه هدف، آغاز کند.

طویل سازی

مرحله گسترش که طویل‌سازی نیز نامیده می‌شود، در دمای 72 درجه سانتیگراد رخ می‌دهد و طی آن با افزایش نسبی دمای محیط، شرایط مناسب برای فعالیت آنزیم Taq پلیمراز و ساخت رشته جدید، مهیا خواهد شد.

دناتوراسیون اولیه

پیش از آغاز اولین چرخه دمایی، ویال حاوی اجزای واکنش، تا رسیدن به دمای 95 درجه سانتیگراد، گرم می‌شود و حدود ۵ دقیقه در این دما باقی می‌ماند. این مرحله، به این منظور انجام می‌شود که هرگونه ساختارهای ثانویه یا پیچ و تاب خوردگی‌های مولکول الگو، کاملا حذف شوند و مولکول، به صورت یک تک‌رشته‌ای خالص در معرض آنزیم قرار گیرد. این مرحله را «واسرشتگی آغازین» یا دناتوراسیون اولیه (Initial Denaturation) می‌نامیم.

طویل سازی نهایی

پس از انجام آخرین چرخه دمایی، ظرف نمونه برای مدت حدود ۵ تا ۱۰ دقیقه دیگر در دمای ۷۲ درجه سانتیگراد، باقی می‌ماند. این مرحله،‌ «گسترش نهایی» یا «طویل‌سازی نهایی» (Final Extension) نام دارد و زمان لازم را فراهم می‌کند تا آنزیم Taq پلیمراز، کار ساخت رشته‌های ناقص را تکمیل کند.

پس از پایان واکنش، ویال (میکروتیوب) حاوی مخلوط واکنش، در دمای 10 درجه سانتیگراد سرد می‌شود و در همین دما باقی می‌ماند، تا پژوهشگر، آن را به یخچال یا فریزر منتقل کند. محصولات PCR را حتی می‌توان تا چند روز در دمای اتاق نیز نگهداری کرد. اما به دلیل احتمال تبخیر نمونه،‌ این کار، معمولا توصیه نمی‌شود.

مراحل یک واکنش PCR ساده در جدول زیر آورده شده است.

واکنش زنجیره ‌ای پلیمراز در دستگاهی به نام ترموسایکلر انجام می‌شود. هر واکنش ساده، بین 2 تا 4 ساعت طول می‌کشد و طی آن، مراحل سه‌گانه فوق،‌ بین 25 تا 35 بار تکرار خواهند شد. اگر PCR موفقیت‌آمیز باشد، تعداد کپی‌های ناحیه هدف، از یک یا تعدادی معدود، به میلیاردها نسخه خواهد رسید. این رشد تصاعدی تعداد نسخه‌ها به این دلیل است که در هر بار تکرار، این تنها مولکول‌های اولیه نیستند که به عنوان الگو به کار می‌روند، بلکه در هر دور، مولکول‌های ساخته شده در تکرارهای پیشین نیز به این مجموعه اضافه می‌شوند. از طرفی، تیوب آزمایش، حاوی مقادیر فراوانی پرایمر و آنزیم است که به این رشته‌ها متصل می‌شوند و سنتز رشته‌های جدید را کاتالیز می‌کنند. به این ترتیب،‌ تعداد نسخه‌ها در هر دور PCR دوبرابر خواهد شد. افزایش تعداد نسخه‌ها از فرمول زیر پیروی می‌کند.

$$N=2^{n}$$

که در آن N، تعداد نسخه‌ها در دور nام واکنش را نشان می‌دهد.

انواع PCR

با اندکی تغییر در اجزا یا شرایط دمایی PCR، می‌توان آن را برای اهداف گوناگونی مناسب‌سازی کرد. انواع مختلف برنامه PCR که به این ترتیب ابداع شده‌اند عبارتند از:

فیلم آموزش طراحی پرایمر با نرم افزار الیگو Oligo

کلیک کنید

• «ریل-تایم  PCR» یا PCR کمی که آن را با qPCR و RT-PCR نیز نشان می‌دهند.
• «PCR معکوس» (Reverse PCR)
• «PCR چندگانه» (Multiple PCR)
• «PCR داخلی» (Nested PCR)
• «PCR با صحت بالا» (High Fidelity PCR)
• «PCR سریع» (Fast PCR)
• «PCR با شروع داغ» (Hot Start PCR)
• «PCR مناطق غنی از CG» یا (GC-Rich PCR)
• «PCR نواحی بلند» (Long-range PCR)
• «PCR با پرایمرهای تصادفی» (Arbitrary Primed PCR)

الکتروفورز محصولات PCR

معمولا برای دیدن محصولات PCR از الکتروفورز بر روی ژل استفاده می‌شود. در این تکنیک، مخلوط DNA درون چاهک‌هایی ریخته می‌شود و با کمک نیروی الکتریکی، درون ژل حرکت می‌کند. می‌دانیم مولکول‌های DNA به دلیل وجود گروه‌های فسفات فراوان، دارای بار منفی هستند. بنابراین با ایجاد جریان الکتریکی، از قطب منفی به سمت قطب مثبت حرکت خواهند کرد. مولکول‌های کوچک‌تر، به راحتی از بین منافذ موجود در ژل، عبور کرده و سریعتر خود را به انتهای آن می‌رسانند. اما حرکت مولکول‌های بزرگتر، به کندی انجام می‌شود. این ویژگی، نکته کلیدی در جداسازی قطعات نوکلئوتیدی است.

هریک از قطعات دیده شده در ژل، یک «باند» (Band) را تشکیل می‌دهند. هر باند، حاوی کپی‌های فراوانی از یک مولکول هدف است. به منظور مشاهده باندها، باید پس از پایان الکتروفورز، آن را رنگ‌آمیزی کنید. یکی از رنگ‌های پرکاربرد در این زمینه، اتیدیوم برماید است که به مولکول DNA متصل و باعث رویت آن در حضور نور UV می‌شود. اما این رنگ، به شدت سمی است و استفاده از آن در پژوهشگاه‌های بزرگ با محدودیت‌های فراوانی همراه است.

امروزه رنگ‌های دیگری، به عنوان جایگزین اتیدیوم برماید به بازار آمده‌اند که به «رنگ‌های ایمن» (Safe Stain) معروفند. رنگ «سایبر-گرین» (SYBR) یکی از این رنگ‌هاست که اتصال آن به DNA دورشته‌ای، موجب می‌شود نمونه، در حضور نور آبی (طول موج 497 نانومتر)، به رنگ سبز (طول موج 520 نانومتر) دیده شود.

برای تشخیص دقیق اندازه باندها می‌بایست آن‌ها را با یک مولکول استاندارد مقایسه کنیم. این مولکول، مارکر نام دارد که به دلیل شکل نردبانی آن، «Ladder» نیز نامیده می‌شود.

کاربردهای PCR

همانطور که گفتیم، به کمک PCR، نسخه‌های فراوانی از یک مولکول هدف به دست می‌آیند که می‌توان آن‌ها را در مراحل بعدی آزمایش به کار گرفت. برخی از کاربردهای رایج این تکنیک عبارتند از:

• شناسایی ژن‌های دخیل در یک اختلال یا بیماری
• شناسایی عامل بیماری عفونی
• تشخیص پزشکی مناسب
• تکثیر یک قطعه از رونوشت ژن (Reverse Transcriptase PCR)
• احراز هویت
• کلونینگ قطعه مورد نظر
• تخمین دقیق تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن (Real-Time PCR)
• تخمین تعداد نسخه‌های رونوشت یک ژن در مقایسه با ژن دیگر (Semi-quantitative PCR)

در مورد شناسایی ژن‌های مرتبط با یک اختلال ژنتیکی، DNA فرد مشکوک به عنوان الگو به کار می‌رود و با DNA فرد سالم مقایسه می‌شود. هرگونه جهش ژنتیکی، منجر به تغییر اندازه توالی مورد نظر خواهد شد. نتیجه آزمایش، با جداسازی قطعات بر روی ژل، قابل مشاهده است.

کیت تشخیص کرونا

امروزه، با کمک کیت‌های تشخیصی مبتنی بر PCR، شناسایی افراد ناقل ویروس کرونا، به سادگی امکان‌پذیر است. اصول کارکرد این کیت‌ها در تصویر زیر نشان داده شده است.

می‌دانیم که ژنوم ویروس کرونا از جنس RNA است. در این روش، از مخاط افراد مشکوک، نمونه‌گیری و RNA آن استخراج می‌شود. در گام بعد، طی فرایند رونویسی معکوس، یک رشته cDNA از روی آن ساخته خواهد شد که به عنوان الگو در واکنش «ریل-تایم PCR» یا (RT-PCR) شرکت می‌کند. در این واکنش،‌ تعداد کپی‌های ویروس کووید-19 در هر میکروگرم از نمونه، دقیقا مشخص می‌شود. اگر این تعداد، کمتر از حد آستانه باشد، فرد «سالم» است. اما اگر بیشتر از حد آستانه استاندارد باشد، فرد، «بیمار» تلقی می‌شود و می‌بایست برای انجام مراحل درمان، به مراکز مربوط مراجعه کند.