انواع کشت سلول – به زبان ساده

کشت سلول یکی از تکنیک‌های آزمایشگاه‌های زیست‌شناسی است. در این تکنیک محیطی شبیه بدن موجود زنده برای تقسیم و رشد سلول فراهم می‌شود. از سلول‌های تکثیر شده می‌توان برای بررسی مسیرهای مولکولی سلول‌های مختلف بدن، اثر دارو بر مکانیسم‌های سلولی، توالی‌يابی ژنوم و کلونینگ استفاده کرد. در این مطلب از مجله فرادرس انواع کشت سلول های جانوری را همراه روش‌های کشت، انواع محیط کشت، آلودگی‌ها و ظروف کشت سلول توضیح می‌دهیم.

کشت سلول چیست ؟

کشت سلولی روشی برای تولید سلول‌های زنده گیاهی و جانوری است. این تکنیک امکان بررسی ژنوم، پروتئین‌ها، تغییرات سلول در پاسخ به داروی جدید، بررسی اثر توکسین باکتری‌ها بر سلول یوکاریوت و بررسی DNA نوترکیب را فراهم می‌کند. در این روش سلول یوکاریوت از نمونه جدا شده زنده یا منجمد، ترکیبات اضافی همراه آن (پروتئین‌های مایع میان‌بافتی یا خون) به‌وسیله روش‌های آنزیمی یا مکانیکی جدا شده و در محیط کشت مناسب قرار داده می‌شود.

فیلم آموزش زیست شناسی سلولی Cell Biology در فرادرس

کلیک کنید

شرایط سلول در این تکنیک شبیه شرایط بدن جاندار است و با مصرف موادغذایی (آمینواسید، نوکلئوتید، کربوهیدرات، مواد معدنی و ویتامین‌ها) موجود در محیط کشت، شرایط محیطی مناسب (دما، درصد گاز اکسیژن و دی‌اکسید کربن، pH و فشار اسمزی) تمام مراحل چرخه سلولی و میتوز را انجام می‌دهد. بر اساس نوع سلول محیط کشت و ابزارهای لازم برای کشت متفاوت است. در هر محیط کشت می‌توان چند رده سلولی غیرمهاجم یا سلول‌های یک رده سلولی با ژنوم مشابه (کلون) کشت تشکیل داد.

انواع کشت سلول جانوری

تکنیک‌های کشت سلول‌های پستانداران بر اساس نوع نمونه اولیه به انواع اولیه، ثانویه (پاساژ) و رده سلولی تقسیم‌بندی می‌شود. در کشت اولیه (Primary cell culture) سلول‌ها به روش‌های مکانیکی یا آنزیمی از بافت بدن جانور یا گیاه جدا شده و در محیط کشت مناسب با مواد غذایی و فاکتورهای رشد تکثیر می‌شود. تکثیر سلول‌های اولیه تا زمانی ادامه دارد که مواد غذایی کافی در محیط وجود داشته باشد. در هر تقسیم میتوز طول تلومرهای کروموزوم کوتاه‌تر شده و پس از چند بار تقسیم این سلول‌ها پیر شده (Senescence) و توانایی تقسیم را از دست می‌دهند.

تلومرهای تکرارهای توالی هگزانوکلئوتید ($$5^\prime TTAGGG3^\prime$$) انتهای کروموزوم هستند که انتهای تک‌رشته‌ای آن‌ها با بخش دورشته‌ای لوپ تشکیل داده و از DNA محافظت می‌کند. کوتاه شدن آن پس از هر تقسیم یکی از مکانیسم‌های سلولی برای جلوگیری از ایجاد تومور است. اما سلول‌های اولیه قبل از پیر شدن و زمانی که مواد غذایی لازم در محیط کاهش یافت یا تراکم سلول‌ها در محیط کشت افزایش یافت، به محیط کشت جدید با فضا و مواد غذایی کافی انتقال داده می‌شود.

سلول‌های اولیه به دو گروه چسبنده و معلق تقسیم می‌شوند که روش کشت و نوع محیط کشت هر کدام متفاوت است. بیشتر سلول‌های جانوری از نوع چسبنده هستند و پس از اتصال به یک سطح پشتیبان تقسیم می‌شوند. این سطح نقش ماتریکس خارج سلولی در بدن را دارد. سلول‌های معلق برای تقسیم به سطح پشتیبان نیاز ندارند و معمولا در محیط‌های مایع کشت داده می‌شوند. سلول‌های خونی از این نوع هستند. اگرچه تعداد دیگری از سلول‌های بدن ازجمله سلول‌های روده و کبدی را نیز می‌توان در محیط کشت مایع و به شکل سوسپانسیون کشت داد. سلول‌های جانوری در محیط کشت با سه موفولوژی شبیه فیبروبلاست، شبیه سلول‌های اپیتلیال و شبیه سلول‌های لنفوسیت رشد می‌کنند.

• سلول‌های شبیه فیبروبلاست دو قطبی یا چندقطبی، طویل و چسبنده هستند.
• سلول‌های شبیه اپیتلیال چندوجهی‌های منظم و از انواع سلول‌های چسبنده هستند. این سلول‌ها در مناطق مجزای فلاسک رشد می‌کنند.
• سلول‌های شبیه لنفوسیت ظاهری کروی دارند و در محیط کشت معلق هستند.

پاساژ سلول

پاساژ سلول فرایند انتقال سلول‌ها از یک محیط کشت به محیط کشت دیگر است. بر اساس سرعت رشد، طول عمر سلول‌ها و زمان لازم برای رسیدن به تغییرات دلخواه یک سلول ممکن دو یا بیش از دو بار به محیط کشت جدید منتقل شود. برای پاساژ سلول‌های چسبنده، ابتدا باید سلول با روش‌های مکانیکی و آنزیمی از سطح ظرف جدا می‌کشود. در روش مکانیکی سلول‌ها به‌وسیله اسکراپر (Scraper) آرام و بدون ایجاد فشار زیاد از ظرف جدا شده و در محیط رشد معلق می‌شود. در روش آنزیمی از پروتئاز تریپسین همراه EDTA برای جدا کردن سلول‌ها از سطح محیط کشت استفاده می‌شود. تریپسین با هیدرولیز پیوندهای پپتیدی و EDTA به یون‌های فلزی محیط متصل شده و از غیرفعال شدن آنزیم تریپسین به‌وسیله یون‌ها جلوگیری می‌کند.

رده سلولی

سلول‌های اولیه توانایی تقسیم محدودی دارند که به‌وسیله ژنوم مشخص می‌شود. بعضی از این سلول‌ها پس از چند بار پاساژ (۲۰ تا ۸۰ بار) و با جهش خودبه‌خودی یا با تراسفورماسیون ژن به سلول‌های پایدار یا «نامیرا» (Immortal) تبدیل می‌شوند. این سلول‌ها ویژگی‌های ژنوتیپی و فنوتیپی یکسانی دارند و کلون تشکیل می‌دهند. از این سلول‌ها می‌توان برای تحقیقات طولانی، بدون نگرانی از تغییر تلومر استفاده کرد. یکی از تفاوت‌های این رده‌های سلولی با سلول‌های اولیه میزان شباهت ژنتیکی و فنوتیپی به سلول‌های بافت جانوری است. سلول‌های اولیه شباهت بیشتری به سلول‌های داخل بدن جانور (in vivo) دارند. رده‌های سلولی را می‌توان با با ترانسفورماسیون ژن به وسیله پلاسمید یا ویروس برای ایجاد جهش در ژن‌های تنظیم چرخه سلولی و افزایش پایداری تلومر ایجاد کرد.

P53 و Rb دو پروتئین مهم تنظیم چرخه سلولی هستند. Rb فسفوریله به پروتئین‌های خانواده E2F (فاکتور رونویسی مرحله طویل شدن) بیان پروتئین‌های عبور از مرحله G1 به S را مهار می‌کند. فعال شدن پروتئین P53 با القای پیر شدن سلول همراه است. یکی از روش‌های ایجاد رده‌های سلولی نامیرا در آزمایشگاه ترانسفکشن (Transfection) آنتی‌ژن T ویروس SV40‌ به سلول‌های اولیه است. این آنتی‌ژن با اتصال به پروتئین‌های Rb و p53 القای پیر شدن سلول را مهار می‌کند. به علاوه این آنتی‌ژن در بعضی از سلول‌های مزوتلیال انسانی با فعال کردن آنزیم تلومراز از کاهش طول تلومر در هر تقسیم و پیر شدن سلول جلوگیری می‌کند.

ویروس سیمپلکس انسانی (HPV) یکی دیگر از وکتورهایی است که برای ایجاد سلول‌های نامیرا استفاده می‌شود. این dsDNA ویروس از سلول‌های بافت مخاطی و پوست انسان برای تکثیر استفاده می‌کند. دو پروتئین E6 و E7 شاخه‌های خطرناک این ویروس (HPV-8,-16,-18,-31) اونکوژن‌های سلول انسانی هستند. به همین دلیل می‌توان از آن‌ها برای ترانسفورماسیون سلول‌های ابتدایی و تشکیل رده‌های سلولی نامیرا استفاده کرد. پروتئین E6 با فعال کردن تلومراز و افزایش سرعت تجزیه p53 به‌وسیله پروتئازهای سلولی، سرعت پیر شدن سلول را کاهش می‌دهد. پروتئین E7 اتصال Rb به E2F و بیان ژن‌های تنظیم چرخه سلولی را مهار می‌کند.

کشت سلول دو بعدی و سه بعدی

محیط طبیعی سلول‌های چسبنده در بدن داربستی برای رشد سلول در سه‌بعد و اتصال به سلول‌های دیگر برای تشکیل بافت ایجاد می‌کند. بر این اساس در محیط آزمایشگاه از محیط کشت دوبعدی و سه‌بعدی برای تکثیر سلول‌ها استفاده می‌شود. سلول‌های چسبنده در محیط کشت دوبعدی یک‌لایه سلولی چسبیده به دیواره یا کف فلاسک تشکیل می‌دهند. قیمت پایین این روش کشت و دسترسی راحت‌تر به سلول‌ها برای انجام آزمایش‌های بعدی (ازجمله تست مرگ سلولی، بررسی توالی DNA هدف، تغییر ساختار آنزیم هدف و اثر جهش القایی در سلول) از مزیت‌های این نوع کشت سلولی است. اما در این کشت سلول مورفولوژی سلول‌ها شبیه محیط طبیعی آن‌ها در بدن نیست و نمی‌توان از آن برای بررسی برهم‌کنش سلول با سلول و سلول با ماتریکس خارج سلولی استفاده کرد.

فیلم آموزش تکنیک های کشت سلول و اصول راه اندازی آزمایشگاه آن در فرادرس

کلیک کنید

در محیط بدن این اتصالات برای تمایزسلولی، انتقال پیام بین سلول‌ها، تقسیم، بقا و بیان ژن‌ها ضروری است. به علاوه تغییر موفولوژی سلول‌ها در این محیط کشت بر عملکرد سلول، سازمان‌یافتگی اسکلت سلولی و ترشح ترکیبات سلولی را تغییر می‌دهد. به علاوه به دلیل مورفولوژی تومورها در محیط طبیعی (توده سلولی) میزان اکسیژن و موادغذایی دریافتی سلول‌های تومور متفاوت است. اما به دلیل رشد تک‌لایه سلول‌ها در محیط کشت دوبعدی، مواد غذایی و اکسیژن یکسان در اختیار سلول‌ها قرار می‌گیرد.

محیط‌های کشت سه‌بعدی بر اساس روش آماده‌سازی به انواع بدون داربست، محیط کشت ژلی و محیط کشت داربستی تقسیم می‌شوند. در این محیط کشت سلول‌ها ساختار کروی چند لایه تشکیل می‌دهند. در این محیط کشت اتصالات ایجاد شده سبب تعامل سلول‌ها و سنتز مولکول‌های پیام‌رسان می‌شود. موفولوژی، متابولیسم، بیان ژن و انتقال پیام سلول‌ها در این محیط سه‌بعدی شباهت بیشتری به سلول‌های اصلی بدن دارد. محیط‌های کشت سه‌بعدی انتخاب بسیار مناسبی برای آنالیز داروهای جدید، اثر دارو بر تومور، بررسی تمایز سلولی، مهاجرت سلول‌ها، فیزیولوژی سلول و بیان ژن‌ها است.

برای مثال شکل تومور در محیط‌های سه‌بعدی شباهت بیشتری به بافت‌های بدن دارد و حساسیت آن به دارو کمتر است. دلیل این کاهش حساسیت ممکن است تغییر دسترسی سلول‌های به مواد غذایی و اکسیژن، تغییر چرخه سلولی یا تغییرات پاتولوژیکی سلول‌ها به دلیل کاهش اکسیژن باشد.

• محیط کشت بدون داربست: در این روش می‌توان از پلیت‌های با چسبندگی کم که تجمع خودبه‌خودی سلول‌ها را افزایش می‌دهد، بیوراکتورها یا میکروپلیت استفاده کرد. یکی از معایب این روش یکدست نبودن اندازه کره‌های سلولی تشکیل شده و یکسان نبودن دسترسی تمام سلول‌ها به دارو یا مواد غذایی برای سلول‌های غیرتوموری است.
• محیط کشت داربستی: داربست سلولی ساختاری رشته‌ای یا غشای منفذدار است که با استفاده از پلیمرهای سنتزی یا طبیعی ساخته می‌شود. ECM خارج شده از سلول‌های جانوری یکی دیگر از انواع داربست‌هایی است که در این نوع کشت استفاده می‌شود. این داربست‌ها به دلیل ایجاد پاسخ ایمنی در کشت سلول‌هایی که مستقیم وارد بدن می‌شوند (سلول‌های بنیادی مهندسی بافت)، کاربرد کمتری دارد. هیدروژل‌ها یکی دیگر از محیط‌های کشت داربستی هستند. این محیط کشت از پلیمرهای جاذب آب (کیتوزان، سدیم آلژینات) ساخته می‌شود.

انواع محیط کشت سلول

نوع محیط کشت انتخابی برای انواع کشت سلول یکی از فاکتورهای مهم این فرایند است. ترکیبات و ویژگی‌های فیزیکی این محیط در تعیین سرعت رشد و طول عمر سلول‌ها نقش دارد. ترکیبات معدنی، سیستم بافر pH، کربوهیدرات‌ها، آمینواسیدها، ویتامین‌ها، پروتئین، اسیدهای چرب و لیپید و آنتی‌بیوتیک ترکیبات اصلی محیط کشت‌های جانوی هستند.

• نمک‌ها ترکیبات ضروری برای تنظیم فشار اسمزی و پتانسیل الکتریکی سلول هستند. نمک‌های پتاسیم و سدیم از ترکیبات اصلی بسیاری از محیط‌های کشت است.
• بیشتر سلول‌ها در pH محیط ۷٫۲ تا ۷٫۴ رشد بهینه دارند. در بدن این pH به‌وسیله سیستم‌های مختلف تنظیم می‌شود. برای تنظیم pH محیط کشت از دو سیستم بافری طبیعی و شیمیایی استفاده می‌شود. سیستم بافری طبیعی تعادل گاز CO2 و بی‌کربنات در محیط کشت است و در روش شیمیایی یک یون زوتریون (مولکول دارای بار مثبت و منفی) به نام HEPES می‌شود. برای تنظیم pH از روش طبیعی، سلول‌ها در انکوباتور CO2 کشت داده می‌شود. این روش ارزان‌تر است و سمیت ایجاد نمی‌کند. قدرت بافری HEPES از سیستم طبیعی بیشتر است اما در غلظت‌های بالای سمیت سلولی ایجاد می‌کند. در بیشتر محیط‌های کشت تجاری از فنول رد به عنوان یک شناساگر تغییرات pH استفاده می‌شود. این شناساگر در محیط اسیدی زرد و در محیط بازی بنفش است.
• کربوهیدرات منبع اصلی تامین انرژی سلول‌ها است. گلوکز، گالاکتوز، فروکتوز و مالتور کربوهیدرات‌های انواع محیط کشت هستند. در بعضی محیط‌های کشت انتخابی پیرووات جایگزین این قندها می‌شود.
• آمینواسیدهای ضروری یکی دیگر ترکیبات لازم برای رشد سلول‌ها در محیط کشت است. غلظت آمینواسید یکی از فاکتورهایی است که تراکم سلول‌ها در محیط کشت را تعیین می‌کند.
• ریبوفلاوین، تیامین و بیوتین سه ویتامین کوفاکتورهای بسیاری از آنزیم‌های متابولیسم و رشد سلول و وجود آن در اکثر محیط‌های کشت ضروری است.
• اسیدهای چرب و لیپیدها به ویژه کلسترول و استروئیدها از ترکیبات ضروری دیگر در محیط‌های کشت غیرسرمی است.
• آنتی‌بیوتیک‌ها برای کاهش آلودگی‌های میکروبی به محیط کشت اضافه می‌شود. پنی‌سیلین و استرپتوماسین دو آنتی‌بیوتیک اصلی در محیط کشت‌های جانوری است.

محیط کشت را می‌توان به انواع سنتزی و طبیعی تقسیم ‌بندی کرد. محیط کشت طبیعی مایعات بدن جانوران، بخشی از بافت، لخته خون یا پلاسما است. پلاسما، سرم (پلاسمای بدون فاکتورهای انعقادی)، سرم بندناف جنینی انسان و مایع آمنیوتیک محیط‌های کشت طبیعی مایعی هستند که در بعضی از انواع کشت سلول می‌توان از آن‌ها استفاده کرد. بافت کبد، طحال، تومورها، لوکوسیت و مغز استخوان، جنین گاو و مرغ، محیط‌های طبیعی بافتی هستند که در کشت سلولی استفاده می‌شوند. تفاوت ترکیبات نمونه‌ای که هر بار از جانور استخراج می‌شود یکی از معایب این محیط‌های کشت است. این ویژگی تکرارپذیری نتایج حاصل از کشت سلول را کاهش می‌دهد.

محیط‌های کشت سنتزی از ترکیب مواد غذایی آلی و معدنی، ویتامین‌ها، انواع نمک، پروتئین‌های سرم، کربوهیدرات‌ها و هورمون‌های رشد تشکیل شده است. درصد و نوع این ترکیبات بر اساس هدف کشت، نوع سلول‌ها و مدت زمان کشت سلول متفاوت است. برای مثال محیط‌های کشت نمکی از ترکیب ساده چند نمک تشکیل می‌شود که pH و فشار اسمزی مشخصی دارد. از این محیط‌ها برای کشت کوتاه‌مدت سلول و در بیشتر موارد جابه‌جایی سلول از یک محیط به محیط دیگر استفاده می‌شود. محیط کشت سرمی، فاقد سرم، شیمیایی و فاقد پروتئین چهار گروه اصلی محیط کشت‌های سنتزی هستند.

• محیط کشت دارای سرم: سرم جنین گاو (FBS) یکی از متداول‌ترین ترکیباتی است که به محیط کشت سلول‌های جانوری اضافه می‌شود. در سرم فاکتورهای رشد لازم برای تقسیم سلولی و ناقل‌های ترکیبات نامحلول، مهارکننده‌های پروتئاز و خنثی‌کننده ترکیبات سمی وجود دارد. هزینه پایین تهیه سرم یکی از مزایای آن و افزایش احتمال ایجاد واکنش‌های ایمونولوژیک یکی از معایب استفاده از این محیط کشت است.
• محیط کشت فاقد سرم: محیط‌های کشت فاقد سرم معمولا برای کشت یک نوع رده سلولی مشخص تولید می‌شود. هورمون‌های رشد و دیگر ترکیبات لازم برای تکثیر سلول‌ها در این سرم به‌وسیله مولکول‌های سنتزی آزمایشگاه یا منابع طبیعی تامین می‌شود.
• محیط کشت شیمیایی: پروتئین این سرم‌ها با تکنیک‌های مهندسی ژنتیک در باکتری یا مخمرها تولید و ویتامین، کلسترول، آمینواسیدهای ضروری و اسیدهای چرب به پروتئین‌ها اضافه می‌شود.
• محیط کشت فاقد پروتئین: این محیط‌های کشت از ترکیبات غیرپروتئینی تشکیل شده است و رشد سلول‌های جانوری و بیان پروتئین‌ها در این محیط کشت نسبت به محیط‌های کشت دارای سرم بیشتر است.

محیط کشت های متداول کشت سلول های جانوری

علاوه بر تقسیم‌بندی بخش قبلی، محیط‌های کشت سنتزی را می‌توان بر اساس ترکیبات به انواع «پایه» (Basal Media) و «پیچیده» (Complex Media) تقسیم‌بندی کرد. فاکتورهای رشد در ترکیب اولیه محیط کشت‌های پایه وجود ندارد و بر اساس نیاز کشت به محیط اضافه می‌شود. MEM و DMEM دو محیط کشت پایه‌ای هستند که برای کشت اولیه و دیپلوئید استفاده می‌شوند. محیط‌های کشت پیچیده معمولا برای کشت سلول‌هایی استفاده می‌شوند که اطلاعات کافی از موادغذایی موردنیاز آن‌ها برای رشد در دسترس نیست یا هدف کشت تولید تعداد زیادی سلول است. RPMI 1640 و IMDM از انواع محیط‌های کشت پیچیده هستند که برای کشت بسیاری از رده‌های سلولی جانوری استفاده می‌شوند.

• MEM: محیط ضروری حداقل ایگل (Eagle’s Minimum Essential Medium | EMEM) یکی از پرکاربرترین محیط‌های کشت است که اولین بار به‌وسیله «هری ایگل» (Harry Eagle) تولید شد. این محیط از ترکیب محلول نمکی، آمینواسیدهای غیرضروری و سدیم پیرووات تشکیل شده است. سیستم بافری MEM غلظت کم بی‌کربنات (۱۵۰۰ میلی‌گرم در لیتر) و دی‌اکسید کربن ۵٪ است. با اضافه کردن سرم یا مکمل‌های دیگر می‌توان از این محیط کشت برای تکثیر رده‌های سلولی مختلف استفاده کرد.
• DMEM: غلظت آمینواسید محیط ایگل تغییر یافته (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | DMEM) دو برابر و غلظت ویتامین‌ها، فریک نیترات و سدیم پیرووات آن چهار برابر محیط MEM است. سیستم بافری این محیط کشت بی‌کربنات (۳٫۷ گرم در لیتر) و CO2 است و هنگام آماده‌سازی محیط اضافه کردن بی‌کربنات الزمامی همراه آب است.
• IMDM: محیط کشت Dulbecco’s تغییریافته (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | IMDM) برای کشت سلول‌هایی مناسب است که رشد سریعی دارند. این محیط کشت از ترکیبات DMEM به اضافه سلنیوم تشکیل شده و سیستم بافری آن HEPES است. در این محیط کشت پتاسیم نیترات جایگزین فریک نیترات شده و غلظت آمینواسید، ویتامین و نمک‌های آن بیشتر از محیط DMEM است.
• RPMI 1640: این محیط کشت فاقد پروتئین، فاکتورهای رشد و لیپیدها است. در تولید RPMI 1640 از سیستم بافری بی‌کربنات/دی‌اکسید کربن برای تنظیم pH استفاده می‌شود. اما برخلاف سایر محیط‌های کشت جانوری pH بهینه آن ۸ است. از RPMI 1640 بیشتر برای کشت سلول‌های معلق ازجمله لنفوسیت‌ها استفاده می‌شود.

انواع آلودگی کشت سلول

آلودگی کشت سلول زمانی ایجاد می‌شود که باکتری‌ها، قارچ، ویروس یا سلول جانوری دیگر (غیر از سلول هدف کشت) وارد محیط کشت شود. این شرایط ممکن است به دلیل عدم رعایت موارد ایمنی اولیه ایجاد شود. رشد میکرواورگانیسم‌ها در محیط کشت موادغذایی در دسترس سلول را کاهش و اسید یا باز آزاد شده از متابولیسم آن‌ها pH محیط کشت را تغییر می‌دهد. به علاوه توکسین‌های ترشح شده از باکتری ممکن است منجر به مرگ سلول‌ها شود. وجود هر یک از این آلودگی‌ها را می‌توان با تغییرات ظاهری ایجاد شده در محیط کشت تشخیص داد.

فیلم آموزش تکنیک های کشت سلول و اصول راه اندازی آزمایشگاه آن

کلیک کنید

• آلودگی باکتریایی: سرعت رشد باکتری‌ها بسیار بیشتر از سلول‌های جانوی است و رشد آن‌ها منجر به کدر شدن محیط کشت می‌شود. متابولیت‌های تولید شده از تغذیه آن pH محیط و رنگ فنول رد را تغییر می‌دهد. به علاوه می‌توان این میکرواورگانیسم‌ها را زیر میکروسکوپ مشاهده کرد. آلودگی ای. کلی و مایکوپلاسما دو آلودگی باکتریایی متداول در انواع کشت سلول جانوری است. اندازه ای. کلی از مایکوپلاسما بزرگ‌تر است و حرکت تاژک آن زیر میکروسکوپ آلودگی این باکتری را تایید می‌کند. مایکوپلاسما بسیار کوچکتر است و حرکت نمی‌کند. کاهش سرعت رشد سلول‌ها در محیط کشت، تنها تغییر ایجاد شده به دلیل آلودگی مایکوپلاسمایی است. آلودگی این باکتری را می‌توان با انجام منظم تست PCR، ELISA یا آنتی‌بادی کانجوگه با نشانگر شناسایی کرد.
• آلودگی قارچی: مخمر و کپک دو گونه قارچ هستند که انواع کشت سلول را آلوده می‌کنند. این میکرواورگانیسم‌ها رشته‌های سلولی در محیط کشت تشکیل می‌دهد که به راحتی زیر میکروسکوپ تشخیص داده می‌شود. رشد آن‌ها با کدر شدن محیط کشت همراه است. در مراحل اولیه آلودگی قارچی pH محیط کشت تغییری ندارد اما با افزایش آلودگی pH محیط افزایش یافته و قلیایی می‌شود. ایجاد بوی نامطلوب یکی دیگر از ویژگی‌هایی است که به تشخیص آلودگی قارچی کمک می‌کند.

• آلودگی ویروسی: ویروس‌ها میکرواورگانیسم‌های بسیار کوچکی هستند که زیر میکروسکوپ نوری دیده نمی‌شوند. به همین دلیل تشخیص آلودگی ویروسی سخت‌تر از آلودگی‌های دیگر است. این میکرواورگانیسم‌ها با استفاده از ترکیبات محیط کشت ازجمله تریپسین یا پروتئین سرم گاوی (FBS) وارد سلول‌ها می‌شود. رشد و تکثیر ویروس‌ها در سلول‌های محیط کشت با تغییر مورفولوژی سلول‌ها همراه است. در مواردی که ژنوم ویروس وارد ژنوم سلول شود، این تغییرات فنوتیپی در رده‌های سلولی بعدی ایجاد خواهد شد. با استفاده از PCR، ELISA، ایمونوسیتولوژی و میکروسکوپ الکترونی می‌توان این آلوده را تشخیص داد.
• آلودگی سلول جانوری: آلودگی سلول‌های محیط کشت با سلول‌های رده دیگر (آلودگی عرضی) یکی از مشکلاتی است که نتیجه آزمایش‌های بعدی را تغییر می‌دهد. این آلودگی تغییر ظاهری در محیط کشت ایجاد نمی‌کند به همین دلیل تشخیص آن از آلودگی‌های میکرواورگانیسمی دشوارتر است. احتمال ایجاد این آلودگی در کشت سلول‌های بنیادی بیشتر است. این سلول‌ها توانایی تمایز به رده‌های مختلف سلولی را دارند و ممکن است در یک محیط کشت به دو رده متفاوت تمایز یابند.

اضافه کردن آنتی‌بیوتیک و ترکیبات ضدعفونی به محیط کشت پس از آلودگی‌های میکرواورگانیسمی، علاوه بر میکرواورگانیسم متابولیسم سلول کشت شده را تغییر می‌دهد. به همین دلیل بهترین راه از بین بردن آلودگی، بیرون ریختن محیط کشت و سلول‌ها برای جلوگیری از گسترش آلودگی و استریل کردن تمام وسایلی (انکوباتور، هود، میکروسکوپ و تمام ظروف استفاده شده) استفاده شده برای کشت سلول است.

انواع ظرف کشت سلولی

پتری دیش، فلاسک T، پلیت‌های چندچاهکی و بیوراکتور ظرف‌های اصلی کشت سلول‌های جانوری هستند. پتری دیش، فلاسک T و پلیت‌ها، ظروف شیشه‌ای یا پلاستیکی متداولی هستند که معمولا در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی برای کشت تعداد کم سلول‌ها استفاده می‌شود. بر اساس تعداد سلول‌های لازم می‌توان از حجم‌های مختلف این ظرف‌ها استفاده کرد.

فیلم آموزش زیست شناسی سلولی و مولکولی – مبانی و مفاهیم مقدماتی در فرادرس

کلیک کنید

بیوراکتورها سیستم‌های جدید کشت سلولی هستند که برای تکثیر تعداد زیاد سلول در مقیاس صنعتی استفاده می‌شوند. اکثر این سیستم‌ها از یک محفظه کشت سلول، لوله‌های تامین مواد غذایی و گازها و سنسورهای تشخیص تغییرات محیطی تشکیل می‌شوند. مخلوط شدن محیط کشت، تنظیم دما، منبع مواد غذایی، کنترل گازها، تنظیم فشار محیط و تشکیل نشدن کف از پارامترهای مهم بیوراکتورها است. مخلوط شدن محیط کشت سبب پراکندگی یک‌نواخت مواد غذایی و اکسیژن در بخش‌های مختلف محیط کشت می‌شود. در بیوراکتورهای مختلف از نیروی مکانیکی یا ایجاد گاز برای این منظور استفاده شده است.

متابولیسم سلول‌های محیط کشت و فعالیت‌های آنزیمی چرخه سلولی با تولید گرما و تغییر pH همراه است. بالا رفتن زیاد دمای محیط کشت یا اسیدی و بازی شدن آن رشد سلول را کند یا متوقف می‌کند. به همین دلیل سنسورهای دما و pH این تغییرات را اندازه‌گیری کرده و امکان تنظیم آن را فراهم می‌کنند. لوله‌های تامین موادغذایی امکان اضافه کردن ترکیبات مصرف شده محیط کشت را فراهم کرده و از کند شدن رشد سلول‌ها جلوگیری می‌کند. لوله‌های تامین گاز، اکسيژن لازم برای رشد سلول را فراهم کرده و سنسورهای گاز میزان فشار لازم این اکسیژن در لوله‌ها و تانک کشت سلولی را تنظیم می‌کنند.

از این سیستم معمولا در صنعت داروسازی و برای تکثیر زیاد سلول‌ها و وکتورهای ویروسی در ژن درمانی و ایجاد محیط سه‌بعدی برای تکثیر سلول، بافت و اندام استفاده می‌شود. «بیوراکتور همزن‌دار» (Stirred-Tank Bioreactor)، «بیوراکتور هوایی» (Airlift Bioreactor)، «بیوراکتور فیبر توخالی» (Hollow Fiber Bioreactor)، «محیط کشت چرخشی» (Rotary Cell Culture System) و «بیوراکتور موجی» (Wave Bioreactor) انواع بیوراکتورهایی هستند که در صنعت و تحقیقات پیش‌بالینی برای کشت سلول و بافت استفاده می‌شود.

• بیوراکتور همزمن‌دار: این بیوراکتورها از یک تانک کشت سلولی (شیشه‌ای برای کشت سلولی آزمایشگاه یا استیل برای کشت سلول‌های صنعتی)، موتور، همزمن و لوله‌های مقاوم به گرما تشکیل شده است. سنسورهای این بیوراکتور به طور مداوم تغییرات pH، دما، غلظت لاکتیک‌اسید، گلوکز، اکسیژن محلول در محیط کشت، آمونیوم، آمونیاک و سایر پارامترهای محیط کشت را ثبت می‌کند. همزمن این بیوراکتور محیط کشت یکسان برای تمام سلول‌ها را فراهم می‌کند. از این بیوراکتور می‌توان برای کشت سلول‌های چسبنده و معلق استفاده کرد.

• بیوراکتور هوایی: در این بیوراکتورها از گاز برای مخلوط کردن محیط کشت در کشت سلولی هوازی استفاده می‌شود. گاز به ستون حبابساز تانک این بیوراکتور تزریق شده و حرکت حباب‌های گاز تشکیل شده از بخش پایینی ستون به بخش‌های بالایی تانک به مخلوط شدن ترکیبات محیط کشت کمک می‌کند. حذف فشار ایجاد شده به‌وسیله چرخش همزمن یکی از مزایای این بیوراکتورها نسبت به انواع همزن‌دار است.
• بیوراکتور فیبر توخالی: بیوراکتور فیبر توخالی‌از مجموعه فیبرهای پلیمری توخالی با نفوذپذیری انتخابی تشکیل شده است که در یک محفظه استوانه‌ای کنار هم قرار می‌گیرند. مواد غذایی و اکسیژن بین غشای داخلی فیبرها و فضای خارجی بر اساس شیب غلظت حرکت می‌کند.
• سیستم کشت سلولی چرخشی: این بیوراکتور از یک کارتیرج خارجی (ثابت) و یک کارتیج داخلی (متحرک) تشکیل شده است. حرکت کارتریج داخلی سبب معلق شدن سلول‌ها در محیط کشت و مخلوط شدن محیط کشت می‌شود.
• بیوراکتور موجی: در این بیوراکتور سلول‌ها در یک کیسه پلاستیکی کشت داده می‌شوند. کیسه پلاستیکی روی شیکری قرار می‌گیرد که دمای آن به‌وسیله کاربر تنظیم می‌شود.این شیکر با سرعت مشخص و در زاویه مشخص (تعیین شده به‌وسیله کاربر) به صورت الاکلنگی بالا و پایین می‌رود. این حرکت سبب می‌شود اکسيژن و موادغذایی در دسترس تمام سلول‌های محیط کشت قرار بگیرد.

سوالات متدوال

در این بخش از مطلب مجله فرادرس به تعدادی از سوالات متداول پیرامون انواع کشت سلول پاسخ می‌دهیم.

دلیل رشد کند سلول ها چیست؟

استفاده از محیط کشت نامناسب یا منقضی شده، آلودگی مایکوپلاسما، پاساژ زودتر از موعد سلول‌ها، آسیب سلول‌ها در زمان فریز یا دفریز شدن، غلظت نامناسب دی‌اکسید کربن، تجمع مواد سمی و نوسان دمای محیط کشت از عواملی است که رشد سلول‌ها را کند یا متوقف یا مرگ سلولی می‌کند.

چرا مورفولوژی سلول ها در محیط کشت تغییر می کند؟

تغییر ترکیبات محیط کشت در زمان رشد سلول، استفاده از محیط کشت قدیمی یا به موقع تعویض نکردن محیط کشت، آلودگی مایکوپلاسما یا رده‌های سلولی دیگر (Cross Contamination)، خطاهای ایجاد شده در پاساژ سلول، اختلال در تبادل گازها و پیر شدن سلول از عواملی است که مورفولوژی سلول را در مراحل مختلف کشت تغییر می‌دهد.

چرا سلول های چسبنده از فلاسک جدا نمی شوند؟

تغییر استوک تریپسین، استفاده از محلول تریپسین قدیمی، فراموش کردن مراحل شست و شوی بافر، باقی ماندن بافر شست و شو در ظرف، استفاده از تریسین بسیار سرد یا غلظت بسیار پایین تریپسین، کم بودن زمان انکوباسیون و رشد متمرکز سلول‌ها از عواملی است که منجر به جدا نشدن سلول‌ها از فلاسک می‌شود.