زیست شناسی، علوم پایه ۴۱۰ بازدید

بیشتر باکتری‌ها بر اساس ترکیبات دیواره سلولی در دو گروه باکتری های گرم مثبت و گرم منفی قرار می‌گیرند. این دسته‌بندی بر اساس برهم‌کنش متفاوت ترکیبات دیواره سلولی با ترکیبات شیمیایی رنگ، در «رنگ آمیزی گرم» (Gram Staining) انجام می‌شود. در این مطلب تفاوت ساختاری و روش‌های شناسایی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی را توضیح می‌دهیم.

فهرست مطالب این نوشته

ساختار باکتری

برای درک بهتر تفاوت‌های باکتری های گرم مثبت و گرم منفی، بهتر است ابتدا ساختار کلی باکتری‌ها را مرور کنیم. باکتری‌ها، پروکاریوت‌های تک‌سلولی هستند که به‌وسیله «تقسیم دوتایی» (Binary Fission) تکثیر می‌شوند. هسته و غشای هسته در این تک‌سلولی‌ها وجود ندارد و کروموزوم آن‌ها، یک DNA دورشته‌ای و حلقوی است. باکتری‌ها از بخش‌های اصلی زیر تشکیل می‌شوند.

مطلب پیشنهادی:
باکتری چیست؟ — به زبان ساده
باکتری ها فراوان‌ترین موجودات زنده جهان به شمار می‌آیند. باکتری‌ها تک سلولی‌های پروکاریوتی هستند که هسته و اندامک‌های غشا دار ندارند.
  • کپسول: این لایه پلی‌ساکاریدی در بعضی گونه‌ها وجود دارد و وظیفه اصلی آن، محافظت از باکتری است.
  • دیواره سلولی: ترکیب اصلی این دیواره، پپتیدوگلایکان است. این لایه در شکل‌گیری باکتری و محافظت آن از خطرات محیط نقش دارد.
  • غشای پلاسمایی: فضای داخلی باکتری‌ها مثل یوکاریوت‌ها به‌وسیله غشایی از جنس پروتئین و لیپید از فضای خارجی جدا می‌شود.
  • سیتوپلاسم: سیتوپلاسم یا پروتوپلاسم باکتری، منطقه‌ای است که واکنش‌های لازم برای رشد، متابولیسم و تکثیر سلول در آن انجام می‌شود.
  • ریبوزوم: ریبوزو‌م‌ها کارخانه‌های میکروسکوپی هستند که در تمام باکتری‌ها وجود دارند. این ساختار‌های مولکولی پیام ژن‌ها را به مولکول‌های پروتئینی ترجمه می‌کنند.
  • نوکلئوئید: نوکلئوئید، منطقه‌ای در سیتوپلاسم باکتری است که کروموزوم حلقوی در آن قرار دارد.
  • تاژک: این ساختار پروتئینی به حرکت باکتری کمک می‌کند اما در همه گونه‌ها وجود ندارد.
  • پیلی: پیلی، زوائد شبیه به مو هستند که در غشای بسیاری از گونه‌های باکتری وجود دارند.
ساختار باکتری
بخش‌های مختلف باکتری

دیواره سلولی باکتری گرم مثبت و گرم منفی

تفاوت باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی ترکیبات متفاوت دیواره سلولی این باکتری‌ها است. دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت از مولکول «پپتیدوگلایکان» (Peptidoglycan) یا «مورین» (Murein) تشکیل شده است که فقط در پریوکاریوت‌ها وجود دارد. لایه پپتیدوگلایکان در باکتری‌های گرم منفی باریک است و در بخش خارجی، لایه لیپوپلی‌ساکاریدی دارد که در باکتری‌های گرم مثبت دیده نمی‌شود.

دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت

باکتری‌های گرم مثبت دیواره سلولی ضخیمی دارند که از چند لایه پپتیدوگلایکان، پلیمرهای تیکوئیک‌اسید و یک لایه نازک لیپیدی، زیر لایه‌های پپتیدوگلایکان تشکیل شده است. ترکیبات مختلف این دیواره را در ادامه بررسی می‌کنیم.

پپتیدوگلایکان

ترکیب اصلی دیواره سلولی (حدود ۹۰٪) در این باکتری‌ها، پپتیدوگلایکان است که در شکل‌گیری سلول و حفظ استحکام دیواره سلولی نقش دارد. همچنین، منافذ موجود در لایه پپتیدوگلایکان شرایط ورود مواد غذایی به سلول را فراهم می‌کند. این درشت‌مولکول از ترکیب کربوهیدرات و اسیدهای آمینه‌‌ غیرمعمول تشکیل می‌شود و ساختاری شبیه ترکیبات پشمی دارد.

  • کربوهیدرات: مولکول‌های «N- استیل گلوکزآمین» (N-acetylglucosamine| NAG) و «N-استیل مورامیک‌اسید» (N-acetylmuramic acid | NAM) در زنجیره‌ای خطی و یکی در میان کنار هم قرار می‌گیرند و با اتصال عرضی بین زنجیره‌ها، لایه‌های دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت را تشکیل می‌دهند.
  • آمینواسید: زنجیره آمینواسیدی علاوه بر L-آمینواسیدها، از سه D-آمینواسید گلوتامیک‌اسید، آلانین و مزو-دی‌آمینوپیملیک تشکیل شده است. این سه اسیدآمینه غیرمعمول، باکتری‌های گرم مثبت را در برابر حمله پروتئازی محافظت می‌کنند.
دیواره سلولی باکتری گرم مثبت
لایه‌های پپتیدوگلایکان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت

تیکوئیک اسید

این پلیمر آنیونی و نامحلول در آب، از واحد‌های پلی گلیسرول فسفات (حدود ۲۰ تا ۳۰ واحد) تشکیل شده است و در بعضی گونه‌ها ازجمله استافیلوکوکوس، استرپتوکوکوس و لاکتوباسیلوس وجود دارد. «تیکوئیک‌اسید» (Teichoic Acid) در تعیین شکل باکتری‌های گرم مثبت و تقسیم دوتایی مشارکت دارد. ۵۰٪ وزن خشک دیواره سلولی را تیوکوئیک‌اسید تشکیل می‌دهد. این پلیمر در برخی گونه‌های گرم مثبت، عامل بیماری‌زایی است. دو نوع تیکوئیک‌اسید در باکتری‌های گرم مثبت وجود دارد.

  • تیوکوئیک اسید متصل به دیواره سلولی که به‌وسیله ۶-هیدروکسل N-استیل مورامیک‌اسید به دیواره متصل می‌شود.
  • لیپوتیکوئیک اسید متصل به غشای سلولی که در شکل‌دهی غشا کمک می‌کند.

میلوئیک اسید

«میکولیک اسید» (Mycolic Acid) در دیواره سلولی همه باکتری‌های گرم مثبت وجود ندارد. این لایه از جنس موم است و در مایکوباکتری‌ها ازجمله مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (عامل بیماری سل)، لایه محافظتی بیشتری ایجاد می‌کند و در اتصال باکتری به سطوح مختلف نقش دارد. به این باکتری‌ها، «اسید-فست» (Acid-Fast) نیز می‌گویند. به دلیل این‌که اسید-فست، روش رنگ‌آمیزی است که برای مشاهده این باکتری‌ها زیر میکروسکوپ نوری استفاده می‌شود.

رنگ‌آمیزی اسید-فست

رنگ‌آمیزی اسید-فست یا «زیل-نیلسون» (Ziehl-Neelsen Staining) یکی از روش‌های تشخیص باکتری‌های گرم مثبتی است که در دیواره سلولی آن‌ها میکوئیک‌اسید وجود دارد. این روش بیشتر برای تشخیص باکتری‌هایی استفاده می‌شود که نسبت به رنگ‌آمیزی گرم مقاوم هستند. مایکوباکتریوم‌های عامل سل در این گروه قرار می‌گیرند.

مراحل رنگ‌آمیزی اسید فست

  1. روی لام تمیز و از قبل ضدعفونی شده، نمونه‌ای از باکتری تهیه کنید.
  2. نمونه را خشک و تثبیت کنید.
  3. تمام سطح نمونه را با رنگ «کربول‌فوشین» (Carbol Fuchsin) پوشش دهید.
    نکته: این رنگ محلول در چربی، پس از گرم کردن نمونه وارد سیتوپلاسم باکتری می‌شود.
  4. لام را به‌وسیله چراغ بنزن گرم کنید تا اولین حباب‌های جوشیدن در رنگ ایجاد شود. سپس نمونه را برای ۵ دقیقه در محیط آزمایشگاه قرار دهید.
  5. لام را با آب مقطر شست‌وشو دهید.
  6. تمام نمونه را با محلول ۳٪ وزنی، هیدروکلروریک‌اسید ۳٪ - الکل ۹۵٪ برای ۵ دقیقه بپوشانید تا رنگ نمونه صورتی کمرنگ شود.
    نکته: حجم زیاد لیپید در باکتری‌های اسید-فست، از نفوذ محلول رنگ‌بر جلوگیری می‌کند. باکتری‌هایی که میلوئیک‌اسید ندارند، در این مرحله بی‌رنگ می‌شوند.
  7. لام را با آب مقطر بشویید.
  8. رنگ متیلن بلو را روی تمام نمونه پخش و ۱ تا ۲ دقیقه صبر کنید.
  9. لام را با آب مقطر شست‌وشو دهید.
  10. پس از خشک کردن لام، با استفاده از لامل، روغن ایمرسیون و لنز $$100 X$$ نمونه را زیر میکروسکوپ نوری مشاهده کنید.
باکتری های گرم مثبت اسید فست
رنگ‌آمیزی اسید-فست برای تشخیص مایکوباکتریوم

دیواره سلولی باکتری گرم منفی

دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی مثل باکتری‌های گرم مثبت از ترکیبات مختلفی تشکیل شده است اما لایه پپتیدوگلایکان در این دو گونه متفاوت است. دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی از قسمت‌های زیر تشکیل می‌شود.

  • لایه پپتیدوگلایکان
  • فضای پریپلاسمی
  • غشای خارجی
  • لیپوپلی‌ساکارید
  • لیپید A
  • آنتی‌ژن O

لایه پپتیدوگلایکان در باکتری های گرم منفی

لایه پپتیدوگلایکان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی روی بخش خارجی غشای پلاسمایی قرار دارد و ۵٪ وزن خشک باکتری را به خود اختصاص می‌دهد. تفاوت لایه پپتیدوگلایکان در باکتری‌های گرم منفی با باکتری‌های گرم مثبت، در تعداد لایه‌ها است. گرم منفی‌ها یک لایه نازک (۲ تا ۷ نانومتر) از پپتیدوگلایکان در دیواره سلولی دارند.

فضای پریپلاسمی

فضای پریپلاسمی، فضای بین غشای پلاسمایی و دیواره سلولی است و با ماتریکسی از آنزیم‌های هیدرولیزی، پروتئین‌های ناقل، آنزیم‌های سنتز پپتیدوگلایکان و آنزیم‌های تجزیه مواد سمی، پر شده است. فضای پریپلاسمی در باکتری‌های گرم منفی بزرگ‌تر است.

غشای خارجی باکتری های گرم منفی

این غشا سمت خارجی لایه پپتیدوگلایکان قرار دارد و از آن ضخیم‌تر (۷ تا ۸ نانومتر) است. لیپوپروتئین‌های مورین، غشای خارجی را به دیواره سلولی متصل می‌کنند. این غشا، سدی در برابر خروج مواد از فضای پریپلاسمی است و از ترکیبات زیر تشکیل شده است.

  • «لیپوپروتئین براون» (Braun’s Lipoprotein): انتهای آبگریز لیپوپروتئین براون یا مورین، در غشای خارجی قرار دارد و با پیوند کوالانسی به لایه پپتیدوگلایکان متصل می‌شود.
  • لیپوپلی‌ساکارید: یکی از ویژگی‌های منحصر به فرد باکتری‌های گرم منفی، وجود «لیپوپلی‌ساکاریدها» (Lipopolysaccharide | LPS) در غشای خارجی است. لیپوپلی‌ساکاریدها بیشترین ترکیب موجود در غشای خارجی هستند و باکتری را در برابر آسیب‌های محیطی محافظت می‌کند. این ترکیب از سه بخش تشکیل شده است.
    • لیپید A: لیپید A، لیپوپلی‌ساکارید را به غشای خارجی متصل می‌کند. لیپید A از دو قند گلیکوزآمینی تشکیل شده است که هر کدام به سه اسید چرب متصل می‌شوند.
    • هسته پلی‌ساکاریدی: هسته پلی‌ساکاریدی دو بخش لیپید A و آنتی‌ژن O را به هم متصل می‌کند.
    • آنتی‌ژن O: این ناحیه متصل به هسته پلی‌ساکاریدی است و توالی و نوع قندهای تشکیل‌دهنده آن در گونه‌های مختلف، تفاوت دارد. آنتی‌ژن O مسئول ایجاد پاسخ آنتی‌بادی در بدن انسان است. به همین دلیل در شناسایی گونه‌های بیماری‌زا از این بخش استفاده می‌شود.
  • پورین‌ها: این ساختارهای پروتئینی کانال‌های انتقال مواد در غشای خارجی هستند و مولکول‌های کوچکی مثل گلوکز با عبور از آن‌ها وارد باکتری گرم منفی می‌شوند. این کانال‌ها مشابه کانال‌های غشای هسته در یوکاریوت‌ها هستند.
دیواره سلولی باکتری گرم منفی
ترکیبات دیواره سلولی باکتری گرم منفی

نقش لیپوپلی‌ساکاری در باکتری های گرم منفی 

لیپوپلی‌ساکارید موجود در دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی، بخشی حیاتی برای این موجود است که در فرایندهای زیر نقش دارد.

  • از باکتری در برابر عوامل خارجی محافظت می‌کند.
  • این ترکیب بارمنفی دارد و سبب منفی شدن سطح سلول و حفظ شکل غشای سلولی می‌شود.
  • لیپید A، اندوتوکسین باکتری و عامل بیماری‌زایی آن است.
  • به کمک غشای خارجی از ورود آنتی‌بیوتیک‌ها، نمک‌های صفرا و عوامل سمی دیگر به سلول جلوگیری می‌کند.

تفاوت دیواره سلوی باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت

باکتری‌های گرم مثبت و منفی دیواره سلولی متفاوتی دارند که رنگ‌آمیزی گرم به شناسایی آن کمک می‌کند. این تفاوت‌ها در جدول زیر توضیح داده شده است.

باکتری های گرم مثبت باکتری های گرم منفی
لایه پپتیدوگلایکان ضخیم دارند. لایه پپتیدوگلایکان نازک دارند.
غشای خارجی ندارند. غشای خارجی دارند.
آنتی‌ژن O اختصاصی ندارند. آنتی‌ژن O اختصاصی دارند.
دیواره سلولی تیکوئیک و لیپوتیکوئیک اسید دارد. دیواره سلولی تیکوئیک و لیپوتیکوئیک اسید ندارد.
در رنگ‌آمیزی گرم، بنفش می‌شوند. در رنگ‌آمیزی گرم، قرمز روشن می‌شوند.
تمام استافیلوکوکوس‌ها و استرپتوکوکوس‌ها و تعدادی از لیستریاها در این گروه قرار می‌گیرند. گونه‌های سالمونلا، انتروباکتر و سودوموناس در این گروه قرار می‌گیرند.

انواع باکتری های گرم مثبت و گرم منفی

علاوه بر رنگ متفاوت باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی زیر میکروسکوپ، شکل ظاهری این باکتری‌ها نیز متفاوت است.

باکتری‌های گرم مثبت

باکتری‌های گرم مثبت با دو شکل اصلی، زیر میکروسکوپ دیده می‌شوند.

  • «کوکسی» (Cocci): این باکتری‌ها کروی یا بیضی با قطر ۰٫۵ تا ۱٫۰ µm هستند. این باکتری‌ها به شکل تک، دوتایی، زنجیره‌ای و خوشه‌ای وجود دارند. استافیلوکوس و استرپتوکوکوس از انواع کوکوس‌های گرم مثبت به حساب می‌آیند.
  • «باسیل» (Bacilli): این باکتری‌های میله‌ای ۱ تا ۱۰ µm طول و ۰٫۳ تا ۱٫۰ µm عرض دارند و در دو انتها برآمده هستند. «باسیلوس اس‌اس‌پی» (Bacillus spp) ازجمله باسیل‌های گرم مثبت است.

کلنی باکتری‌های گرم مثبت به دو شکل زیر کنار هم قرار می‌گیرند.

  • تتراد: این کوکسی‌ها، خوشه‌های مربعی و ۴تایی تشکیل می‌دهند. میکروکوکوس اس‌اس‌پی ازجمله این باکتری‌های گرم مثبت است.
    کوکوس گرم مثبت
    تتراد میکروکوکوس SSP زیر میکروسکوپ
  • سارسینا (اوکتا): این کوکسی‌های گرم مثبت دیواره سلولی ضخیمی دارند و به شکل خوشه‌های ۴تایی یا مکعب هشت وجهی دیده می‌شوند. سارسینا app ازجمله کوکسی‌های گرم مثبت است.
    کوکسی گرم مثبت
    مشاهده آرایش ۸تایی سارسینا app پس از رنگ‌آمیزی گرم

باکتری‌های گرم منفی

شکل باکتری‌های گرم منفی زیر میکروسکوپ بسیار متنوع است. شکل های متداول این باکتری‌ها، میله‌ای، باسیل، کوکسی و مارپیچی است. باکتری‌های زیر مثالی برای شکل های مختلف باکتری‌های گرم منفی هستند.

  • باسیل: باکتری‌های میله تک - ای کلی
  • کوکوباسیل: ترکیبی از کوکسی و باسیل - «هموفیلوس انفولانزا» (Hemophilus influenza)
  • استرپتوکوکوس: زنجیره‌ای از باکتری‌های میله‌ای - استرپتوباسیلوس مونیلی‌فورمیس (Streptobacillus moniliformis)
  • تریکوم: آرایش ستونی در مجموعه‌ای از باکتری‌های میله‌ای گاهی همراه با غلاف محیطی
  • باکتری‌های مارپیچی: اسپیروشیت‌ها - «کلامیدا تراکوماتیس» (Chlamydia trachomatis)
    باکتری گرم منفی مارپیچی
    تصویر میکروسکوپی ترپونما پالیدوم، باکتری گرم منفی مارپیچی و عامل سفلیس
  • باکتری‌های رشته ای: گرم منفی‌های رشته‌ای - «نورکادیا اس‌اس‌پی» (Norcadia spp)

تشخیص باکتری های گرم مثبت و گرم منفی

باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی را می‌توان بر اساس ویژگی‌های ظاهری آن‌ها پس از رنگ‌آمیزی یا به کمک واکنش‌های آنزیمی و بیوشیمیایی تشخیص داد.

روش رنگ‌آمیزی گرم

رنگ‌آمیزی گرم، روشی است که برای تشخیص باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی در عفونت‌های گلو، ریه، سیستم تناسلی و زخم‌های پوستی استفاده می‌شود. این رنگ‌آمیزی در بررسی مایعات بدن ازجمله خون و ادرار نیز کاربرد دارد. رنگ‌آمیزی گرم بر اساس برهم‌کنش ترکیبات دیواره سلولی با رنگ ویوله، باکتری‌ها را تقسیم‌بندی می‌کند. اگر پس از اتمام این فرایند، باکتری رنگ بنفش داشته باشد، گرم مثبت و اگر رنگ آن به قرمز یا صورتی تغییر کند، گرم منفی است.

  • باکتری گرم مثبت: لایه ضخیم پپتیدوگلایکان به حفظ غشای پلاسمایی باکتری کمک می‌کند و جایگاهی برای اتصال مولکول‌های دیگر است. بلورهای «رنگ ویوله» (Violet Dye) در این لایه‌ها به دام می‌افتد و باکتری زیر میکروسکوپ بنفش دیده می‌شود.
  • باکتری گرم منفی: لایه نازک پپتیدوگلایکان رنگ ویوله را حفظ نمی‌کند و در عوض ترکیبات دیواره به رنگ سافرانین متصل و باکتری قرمزرنگ می‌شود.

مراحل انجام رنگ آمیزی باکتری‌های گرم منفی و مثبت

برای شروع رنگ‌آمیزی گرم به لوازم زیر نیاز دارید.

  • نمونه باکتریایی
  • لام و لامل
  • رنگ کریستال ویوله
  • ید یا لوگول
  • الکل ۹۵٪
  • الکل ۷۰٪
  • رنگ سافرانین
  • «روغن ایمرسیون» (Oil-immersion)

این روش در ۴ مرحله زیر انجام می‌شود.

  • آماده‌سازی نمونه
  • رنگ‌آمیزی اولیه لام
  • رنگ‌بری لام
  • رنگ‌آمیزی باکتری گرم منفی

آماده‌سازی نمونه برای رنگ آمیزی باکتری‌های گرم منفی و مثبت

تهیه نمونه از دو محیط کشت مایع و جامد متفاوت است.

  • محیط کشت مایع: لوپ را به‌وسیله چراغ بنزن استریل کنید و پس از اینکه کاملا خنک شد، قطره‌ای از محیط کشت را به‌وسیله آن روی لامی قرار دهید که از قبل با الکل ۷۰٪ ضدعفونی شده است. سپس قطره را با چرخش دایره‌ای شکل لوپ روی لامل پخش کنید. اگر چگالی باکتری در محیط کشت زیاد است، باید نمونه را قبل از قرار دادن روی لامل رقیق کنید.
  • محیط کشت جامد: ابتدا به کمک لوپ و بافر فسفات سالین استریل، سوسپانسیونی از نمونه باکتریایی تهیه و سپس مثل روش محیط کشت مایع، لام نمونه را آماده کنید.

پس از آماده شدن نمونه، لام را در محیط آزمایشگاه قرار دهید تا لکه یا «اسمیر» (Smear) باکتری کاملا خشک شود. سپس، برای از بین بردن آلودگی‌های احتمالی لام را چند مرتبه از شعله چراغ بنزن رد کنید.

رنگ آمیزی اولیه لام

قبل از شروع رنگ‌آمیزی مطمئن شوید نمونه روی لام کاملا خشک شده است. سپس مراحل زیر را دنبال کنید.

  • رنگ کریستال ویوله را به‌وسیله قطره‌چکان و آرام روی تمام نمونه پخش کنید. پس از یک دقیقه لام را با آب مقطر بشویید.
    نکته: کریستال ویوله رنگی محلول در آب است که وارد لایه‌های دیواره سلولی می‌شود.
  • محلول یُد یا لوگول را به‌وسیله قطره‌چکان و آرام روی تمام نمونه پخش کنید. پس از یک دقیقه محلول اضافی را دور بریزید و لام را با آب مقطر بشویید. در این مرحله رنگ اسمیر مشکی یا بنفش تیره می‌شود.
    نکته: محلول ید مخلوطی از ید و پتاسیم‌یدید است که با کریستال ویوله کمپلکسی بزرگ و نامحلول در آب تشکیل می‌دهد.

رنگ بری لام

برای رنگ‌بری باکتری‌های گرم‌منفی، از اتانول ۹۵٪ یا استون استفاده کنید. لام را آرام تکان دهید تا تمام سطح نمونه را پوشش دهد. پس از ۵ تا ۱۰ ثانیه، لام را با آب مقطر شست‌وشو دهید.

نکته: در این مرحله، لایه پپتیدوگلایکان جمع می‌شود. در باکتری‌های گرم مثبت، کمپلکس کریستال ویوله بین لایه پپتیدوگلایگان به دام می‌افتد و باکتری بنفش‌رنگ دیده می‌شود. در باکتری‌های گرم منفی، لایه لیپیدی از بین می‌رود، کمپلکس کریستال ویوله از لایه نازک پپتیدوگلایکان خارج می‌شود و باکتری بی‌رنگ می‌شود.

رنگ آمیزی باکتری گرم منفی

رنگ سافرانین را به‌وسیله قطره‌چکان و آرام روی تمام نمونه پخش کنید. پس از ۴۵ ثانیه، رنگ اضافه را بیرون بریزید و لام را با آب مقطر بشویید.

نکته: سافرانین حلالیت کمی در آب دارد و دیواره سلولی باکتری گرم منفی را قرمررنگ و امکان تمایز باکتری‌های گرم منفی و گرم مثبت را فراهم می‌کند.

رنگ آمیزی گرم
مراحل انجام رنگ‌آمیزی گرم. در پایان این رنگ‌آمیزی باکتری‌های گرم منفی قرمزرنگ و باکتری‌های گرم مثبت بنفش‌رنگ دیده می‌شوند.

مشاهده باکتری‌های گرم منفی و مثبت زیر میکروسکوپ

پس از انجام مراحل بالا و پایان رنگ‌آمیزی گرم، می‌توانید با استفاده از روغن ایمرسیون و لامل نمونه را زیر میکروسکوپ نوری مشاهده کنید.

باکتری گرم منفی زیر میکروسکوپ
تصویر باکتری گرم منفی (راست) و باکتری گرم مثبت (چپ) پس از رنگ‌آمیزی گرم

تست‌های بیوشیمیایی

فرایندهای حیاتی سلول‌های مختلف ازجمله باکتری‌ها به کمک گروهی از پروتئین‌ها به نام آنزیم انجام می‌شود. گونه‌های مختلف باکتری برای انجام فرایندهای متابولیسمی خود به آنزیم‌های متفاوتی نیاز دارند که می‌توان با بررسی آن‌ها نوع باکتری را تشخیص داد.

تست کاتالاز

بسیاری از باکتری‌های هوازی و «باکتری‌های متغیر» (Facultatively Anaerobic) آنزیم کاتالاز تولید می‌کنند. این آنزیم هیدروژن‌پراکسید تولید شده از فعالیت دسموتاز را خنثی می‌کند. در بعضی باکتری‌های متغیر، آنزیم پروکسیداز این واکنش را انجام می‌دهد و باکتری‌های بی‌هوازی هیچ کدام از آنزیم‌های کاتالاز یا پروکسیداز را ندارند. کاتالاز، در جایگاه فعال خود یک گروه هِم دارد و واکنش زیر را کاتالیز می‌کند.

$$2 H_2O_2 → 2 H_2O + O_2$$

تست کاتالاز، برای تشخیص باکتری‌های گرم مثبت استفاده می‌شود. با این تست می‌توان استافیلوکوکوس‌ را از استرپتوکوکوس و میکروکوکوس‌ها را از انتروکوکوس‌ها تشخیص داد.

تست کاتالاز
الف) یک قطره هیدروژن پرواکسیداز ۳٪ را روی لام بریزید. ب) نمونه باکتری را به‌وسیله لوپ پلاستیک با محلول $$H_2O_2$$ مخلوط کنید. ج) باکتری‌های کاتالاز مثبت حباب‌های اکسیژن ایجاد می‌کنند که نشان‌دهنده وجود آنزیم است. د) باکتری‌های کاتالاز منفی حباب گازی تولید نمی‌کنند.

تست اکسیداز

سیتوکروم c اکسیداز معمولا در باکتری‌های هوازی وجود دارد. وجود این ترکیب یکی از راه‌های شناسایی باکتری‌های گرم منفی است. در این آزمایش از یک گیرنده الکترون کمک گرفته می‌شود که با اکسایش یا کاهش تغییر رنگ می‌دهد. سیتوکروم c اکسیداز، پروتئینی عرض غشایی است که در غشای داخلی میتوکندری هم وجود دارد. این پروتئین، آخرین آنزیم در زنجیره انتقال الکترون است و علاوه بر ترکیب کردن اکسیژن و هیدروژن و تولید مولکول آب، پروتون ایجاد شده از این واکنش را از سلول خارج می‌کند. فرمولی که در ادامه مشاهده می‌کنید، واکنش اکسایش کاهش سیتوکروم را نشان می‌دهد.

$$4 Fe^{2+}-cytochrome c_{red} + 8H^+_{in} + O_2 → 4 Fe^{3+}-cytochrome c_{ox} + 2H_2O + 4H^+_{out}$$

تست اکسیداز
الف) ۲ قطره واکنشگر اکسیداز روی فیلتر کاغذی بریزید. ب) کلنی باکتری را به‌وسیله لوپ پلاستیکی روی فیلتر قرار دهید. ج) کلنی سمت چپ شامل باکتری‌های اکسیداز مثبت و کلنی سمت راست شامل باکتری‌های اکسیداز منفی می‌شود. د) نتیجه نهایی ۳۰ ثانیه پس از مخلوط شدن باکتری و واکنشگر مشاهده می‌شود.

تست پتاسیم هیدروکسید

هدف از انجام تست پتاسیم‌هیدروکسید ($$KOH $$) شناسایی باکتری‌های گرم منفی است. پتاسیم‌هیدروکسید، لایه نازک پپتیدوگلایکان در دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی را در خود حل می‌کند اما اثری بر دیواره سلولی باکتری‌های گرم مثبت ندارد. از بین رفتن دیواره سلولی بر اثر نفوذ $$KOH $$ غشای پلاسمایی سلول را تجزیه و مولکول‌های DNA را آزاد می‌کند. DNA ویسکوزیته محلول باکتریایی را افزایش می‌دهد و نمونه به لوپ می‌چسبد. پتاسیم‌هیدروکسید، تغییری در دیواره سلولی باکتری گرم مثبت ایجاد نمی‌کند، به همین دلیل ویسکوزیتی محلول باکتری پس از اضافه شدن KOH تغییر نخواهد کرد و می‌توان آن را از باکتری گرم منفی تشخیص داد.

تشخیص باکتری گرم
الف) محلول پتاسیم‌هیدروکسید را روی لام می‌ریزیم. ب) باکتری با $$KOH $$ مخلوط می‌شود. ج) ویسکوزیته سوسپانسیون باکتری گرم منفی افزایش پیدا می‌کند و به لوپ می‌چسبد. د) پتاسیم‌هیدروکسید روی سوسپانسیون باکتری گرم مثبت بی‌اثر است.

آنتی بیوتیک های باکتری های گرم مثبت و گرم منفی

باکتری‌های کرم مثبت و گرم منفی هر دو عفونت‌هایی در بدن انسان ایجاد می‌کنند که درمان نشدن آن‌ می‌تواند حتی منجر به مرگ او شود. به همین دلیل دانشمندان آنتی‌بیوتیک‌ها را برای از بین بردن باکتری‌های داخل بدن و درمان عفونت ناشی از آن‌ها تولید کردند. مکانسیم عمل آنتی‌بیوتیک‌های مختلف با هم متفاوت است. در دو جدول زیر، آنتی‌بیوتیک‌های موثر بر باکتری‌های گرم مثبت و منفی و مکانسیم عمل آن‌ها آمده است.

آنتی بیوتیک گرم مثبت
برای مشاهده جدول کامل روی تصویر کلیک کنید.

جدول زیر آنتی‌بیوتیک‌های موثر بر باکتری‌های گرم منفی و مکانیسم عمل آن‌ها را نشان می‌دهد.

داروی باکتری گرم منفی
برای مشاهده جدول کامل روی تصویر کلیک کنید.

بیماری‌زایی باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی

باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی به‌وسیله آنتی‌ژن‌های سطحی یا ترشح پروتئین‌های سمی، انسان را بیمار می‌کنند.

  • باکتری‌های گرم مثبت: این باکتری‌ها به ‌وسیله ترشح اگزوتوکسین‌ها یا برهم‌کنش تیکوئیک‌اسید با مولکول‌های زیستی، بدن را آلوده می‌کنند.
    • اگزوتوکسین: اگزوتوکسین در سیتوپلاسم باکتری ساخته می‌شود.
    • تیکوئیک‌اسید: این پلیمر به سه روش در بیماری‌زایی باکتری‌ها نقش دارد.
      • اتصال باکتری به بافت میزبان را تسهیل می‌کند. برای مثال استافیلوکوکوس پیوجنز باکتری گرم مثبتی است که به‌وسیله لیپوتیکوئیک‌اسید و پروتئین M به مخاط حلق می‌چسبد.
      • به‌وسیله مکانیسم مشابه اندوتوکسین در باکتری گرم منفی، عفونت سیستمی‌ ایجاد می‌کند.
      • با تحریک ترشح اینترلوکین۱ و فاکتور نکروزکننده تومور از ماکروفاژها، عفونت سیستمی ایجاد می‌کند.
        لیپوتیکوئیک اسید
        ساختار لیپوتیکوسیک اسید در باکتری گرم مثبت
  • باکتری‌های گرم منفی: LPS اندوتوکسین باکتری‌های گرم منفی است که در بدن انسان «عفونت سیستمی» (Septic Shock) و التهاب ایجاد می‌کند.

تفاوت اندوتوکسین و اگزوتوکسین باکتری های گرم

توکسین‌های باکتریایی، مواد سمی هستند که سیستم ایمنی بدن انسان را فعال می‌کنند. این مولکول‌ها براساس شیوه تولید، به دو دسته تقسیم می‌شوند.

  • اندوتوکسین: اندوتوکسین‌ها مولکول‌های LPS مقاوم به گرما هستند که پس از مرگ باکتری در بدن آزاد می‌شوند.
  • اگزوتوکسین: این آنتی‌ژن‌های پروتئینی در بعضی از گونه‌های باکتریایی تولید می‌شوند و مقاومت کمتری نسبت به گرما دارند. اگزوتوکسین‌ها سه دسته هستند.
    • «سیتوتوکسین» (Cytotoxins): سلول میزبان را کامل از بین می‌برند یا عملکرد آن را تغییر می‌دهند.
    • «نوروتوکسین» (Neurotoxins): عملکرد سیستم عصبی را مختل می‌کنند. توکسین عامل کزاز و بوتولیسم از این نوع هستند.
    • «انتروتوکسین» (Enterotoxins): این توکسین‌ها با مختل کردن عملکرد سیستم گوارش اسهال و استفراغ ایجاد می‌کنند. توکسین عامل وبا از این نوع است.

اندوتوکسین و اگزوتوکسین تفاوت‌های ساختاری و عملکردی دارند.

اندوتوکسین اگزوتوکسین
مولکول‌های ساختاری هستند. پروتئین‌های ترشحی هستند.
ژن‌های آن روی کروموزوم اصلی قرار دارد. ژن آن‌ها روی پلاسمید قرار دارد.
سمیت ضعیف و ایمنی‌زایی کمی دارند. سمیت و ایمنی‌زایی زیادی دارد.
با از بین رفتن باکتری گرم منفی بیماری ایجاد می‌کنند. در باکتری‌های گرم مثبت و منفی زنده تولید می‌شود.
وزن مولکولی آن‌ها بین ۵۰ تا ۱۰۰۰ کیلودالتون (KDa) است. وزن مولکولی آن ۱۰ کیلودالتون است.
مقاوم به گرما هستند و تا ۱۰۰۰ درجه سانتی‌گراد را تحمل می‌کنند. مقاومت گرمایی کمی دارد و در ۶۰ تا ۸۰ درجه سانتی‌گراد از بین می‌رود.
با جوشاندن دناتوره نمی‌شوند. با جوشاندن دناتوره می‌شود.
علائم کلی آن شامل تب، اسهال و استفراغ می‌شود. علائم ان شامل موارد انتروتوکسین، نوروتوکسین و سیتوتوکسین می‌شود.
به‌وسیله آنتی‌بادی خنثی نمی‌شود. به‌وسیله آنتی‌بادی خنثی می‌شود.
میزان زیادی از آن برای ایجاد بیماری نیاز است. یک مولکول اگزوتوکسین برای ایجاد بیماری کافی است.
واکسن موثری ندارد. واکسن موثر علیه آن وجود دارد.
ای کلی، شیگلا، ویبریو کلرا و سالمونلا تیفی اندوتوکسین دارند. کلستریودیوم تتانی، استافیلوکوکوس ائورئوس، باسیلوس آنتراسیس اگزوتوکسین ترشح می‌کنند.
عامل عفونت‌های سیتمی است. عامل بیماری‌های بوتولیسم، کزاز و دیفتری است.

باکتری‌های گرم متغیر

باکتری‌های گرم متغیر در هیچ یک از دسته‌های گرم مثبت یا گرم منفی قرار نمی‌گیرند. به دلیل اینکه رنگ آن‌ها پس از رنگ‌آمیزی گرم، ترکیبی از بنفش و قرمز است. دیواره سلولی این باکتری‌ها شبیه به باکتری‌های گرم مثبت است اما بعضی از آن‌ها پس از رنگ‌آمیزی گرم، رنگ قرمز می‌گیرند. کلستریدیوم تتانی (عامل بیماری کزاز) یکی از این باکتری‌ها است.

جمع‌بندی

تقسیم‌بندی باکتری‌ها به دو دسته باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی، براساس پاسخ ترکیبات موجود در دیواره سلولی آن‌ها به روش رنگ‌آمیزی گرم انجام شده است و تشخیص باکتری‌ها برای انتخاب آنتی‌بیوتیک و روش درمانی مناسب را تسهیل می‌کند.

سوالات متداول در مورد باکتری های گرم مثبت و گرم منفی

در ادامه این مطلب سعی کرده‌ایم به تعدادی از سوال‌های رایج پیرامون باکتری‌های گرم مثبت و منفی پاسخ دهیم.

چرا تشخیص باکتری های گرم مثبت و گرم منفی مهم است ؟

دیواره سلولی باکتری‌های گرم منفی به دلیل نفوذ پذیری کمتر دیواره سلولی، به آنتی‌بادی‌های بدن مقاوم‌تر است و نیاز به روش درمانی متفاوتی دارد.

تفاوت اصلی باکتری های گرم مثبت و گرم منفی چیست ؟

لایه پپتیدوگلایکان دیواره سلولی در باکتری‌های گرم مثبت ضخیم‌تر است و در رنگ‌آمیزی گرم بنفش‌رنگ می‌شوند. اما لایه پپتیدوگلایکان باکتری‌های گرم منفی نازک‌تر است و در رنگ‌آمیزی گرم، قرمزرنگ می‌شوند. باکتری‌های گرم مثبت اندوتوکسین ندارند.

سلب مسئولیت مطالب سلامت: این مطلب صرفاً‌ با هدف افزایش آگاهی عمومی در زمینه سلامت نوشته شده است. برای تشخیص و درمان بیماری‌ها، لازم است حتماً از دانش و تخصص پزشک یا دیگر افراد متخصص مرتبط استفاده شود. مسئولیت هر گونه بهره‌برداری از این مطلب با جنبه درمانی یا تشخیصی، بر عهده خود افراد بوده و مجله فرادرس هیچ مسئولیتی در این رابطه ندارد. برای اطلاعات بیشتر + اینجا کلیک کنید.

اگر این مطلب برای شما مفید بوده است، آموزش‌ها و مطالب زیر نیز به شما پیشنهاد می‌شوند:

بر اساس رای ۱۰ نفر
آیا این مطلب برای شما مفید بود؟
شما قبلا رای داده‌اید!
اگر بازخوردی درباره این مطلب دارید یا پرسشی دارید که بدون پاسخ مانده است، آن را از طریق بخش نظرات مطرح کنید.

مرضیه پیمان فارغ‌التحصیل کارشناسی ارشد نانوفناوری پزشکی است. در زمینه ترجمه متون تخصصی و کاربردهای نانو‌ساختارها در پزشکی فعالیت می‌کند. در حال حاضر در زمینه تولید‌ محتوای زیست‌شناسی با فرادرس همکاری می‌کند.