کشت میکروبی یا کشت باکتری روشی برای تکثیر میکروبی است که به آن‌ها اجازه می‌دهد در شرایط آزمایشگاهی کنترل شده در محیط کشت از پیش تعیین شده تکثیر شوند. کشت باکتری روشی تشخیصی بنیادی و اساسی است که به عنوان ابزاری تحقیقاتی در زیست‌شناسی مولکولی و همین‌طور برای تشخیص بیماری‌ها در علوم پزشکی و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در ادامه این مطلب به تجهیزات لازم، روش‌ها و کاربردهای هریک از آن‌ها در کشت باکتری می‌پردازیم.

فهرست مطالب این نوشته پنهان کردن

کشت میکروبی چیست؟

مطالعه میکروارگانیسم‌ها اگر بتوانیم آن‌ها را کشت کنیم، یعنی جمعیت تولید مثل را در شرایط آزمایشگاهی زنده نگه داریم، بسیار تسهیل می شود. کشت بسیاری از میکروارگانیسم‌ها به دلیل نیازهای غذایی و محیطی بسیار خاص و تنوع این نیازها در بین گونه های‌مختلف، چالش برانگیز است. از کشت باکتری برای تعیین نوع ارگانیسم، فراوانی آن در نمونه مورد آزمایش یا هر دو استفاده می‌شود. این یکی از روش‌های تشخیصی اولیه میکروبیولوژی است و به عنوان ابزاری برای تعیین علت بیماری عفونی با اجازه تکثیر عامل در یک محیط از پیش تعیین شده استفاده می‌شود.

پیش از این در یکی از پست‌های فرادرس تحت عنوان باکتری چیست؟ — به زبان ساده در مورد این میکروارگانیسم و انواع آن توضیح داده شده است و می‌توانید در این مطلب بیشتر در این رابطه مطالعه کنید. به عنوان مثال، یک کشت گلو با تراشیدن پوشش بافتی در پشت گلو و نمونه‌برداری از نمونه در محیط انجام می‌شود تا بتوان از نظر وجود میکروارگانیسم‌های مضر مانند استرپتوکوک پیوژنز، عامل ایجاد کننده استرپتوکوک گلو آن را مورد بررسی قرار داد. به علاوه، اصطلاح کشت به طور غیر رسمی برای اشاره به رشد انتخابی نوع خاصی از میکروارگانیسم‌ها در آزمایشگاه استفاده می‌شود.

جداسازی کشت میکروارگانیسم‌ها اغلب ضروری است. یک کشت خالص (Axenic) جمعیتی از سلول‌ها یا ارگانیسم‌های چند سلولی است که در غیاب گونه ها یا انواع دیگر رشد می‌کنند. یک کشت خالص ممکن است از یک سلول یا ارگانیسم منشأ گرفته باشد، در این صورت سلول‌ها کلون ژنتیکی یکدیگر هستند. به منظور ژل زدن کشت میکروبی، از محیط ژل آگارز (آگار) استفاده می‌شود. آگار یک ماده ژلاتینی است که از جلبک دریایی گرفته شده است. یک جایگزین ارزان برای آگار، آدامس گوار است که می‌تواند برای جداسازی و نگهداری ترموفیل‌ها مورد استفاده قرار گیرد.

در یکی از آموزش‌های فرادرس در چند فصل تاریخ میکروبیولوژی، میکروسکوپ، ساختار، ژنتیک، متابولیسم و رشد میکروارگانیسم‌ها مورد بحث قرار می‌گیرند و پس از تماشای آن مخاطبان با ساختار میکروارگانیسم‌ها و فعالیت‌های بی‌نظیر آن‌ها آشنا خواهند شد.

کشت باکتری چیست

کاربرد کشت باکتری چیست؟

باکتری ها در آب، خاک و غذا، روی پوست و فلور طبیعی دستگاه روده وجود دارند. مجموعه‌ای از میکروب‌ها که در محیط و بدن انسان وجود دارد بسیار زیاد هستند. بدن انسان میلیاردها باکتری دارد که باعث ایجاد فلور طبیعی می‌شود و علیه عوامل بیماری‌زا مهاجم مبارزه می‌کنند. باکتری‌ها اغلب در جمعیت‌های مختلط رشد می‌کنند.

بسیار نادر است که در یک محیط فقط یک نوع باکتری وجود داشته باشد. برای اینکه بتوان خصوصیات کشت، ریخت‌شناسی و فیزیولوژیکی یک گونه را مطالعه کرد، تقسیم باکتری‌ها از سایر گونه‌هایی که به طور کلی از محیط منشا می‌گیرند بسیار حیاتی است. این مهم در تعیین باکتری در یک نمونه بالینی مهم است. هنگامی که باکتری به صورت رگه‌ای و جدا شده باشد، می‌توان عامل بیماری باکتریایی را شناسایی کرد.

نمونه برداری باکتری
یکی از کاربردهای مهم کشت باکتری در علوم پزشکی، نمونه برداری برای تشخیص بیماری است.

محیط کشت باکتری چیست؟

محیط کشت باکتری باید به گونه‌ای تهیه شود که قبل از تلقیح با یک باکتری خاص، استریل باشد تا تنها نوع باکتری موجود در نمونه باشد. محیط کشت باید هر آنچه باکتری برای تکثیر نیاز دارد را فراهم کند، بنابراین دما، اسیدیته، نوع بستر، مواد غذایی و اکسیژن اهمیت دارند. تعداد محیط موجود برای رشد باکتری قابل توجه است. برخی از محیط‌های کشت عمومی از رشد طیف وسیعی از ارگانیسم ها پشتیبانی می‌کنند. یک نمونه برجسته از یک محیط همه منظوره، آبگوشت سویا آزمایشگاهی (TSB) است.

از محیط‌های تخصصی در شناسایی باکتری‌ها استفاده می‌شود و با رنگ‌ها، شاخص‌های pH یا آنتی‌بیوتیک‌ها تکمیل می‌شود. یک نوع ماده غنی شده شامل فاکتورهای رشد، ویتامین‌ها و سایر مواد مغذی ضروری برای رشد ارگانیسم‌های سریع‌الرشد است، ارگانیسم‌هایی که نمی‌توانند مواد مغذی خاصی ایجاد کنند و نیاز به افزودن آن‌ها به محیط دارند.

وقتی ترکیب شیمیایی کامل یک محیط شناخته شود، آن را یک محیط شیمیایی تعریف شده می‌نامند. به عنوان مثال در محیط EZ، تمام اجزای شیمیایی منفرد شناسایی شده و مقدار دقیق هر یک از آن‌ها مشخص است. در محیط‌های پیچیده که حاوی عصاره و هضم مخمرها، گوشت یا گیاه هستند، ترکیب شیمیایی دقیق محیط شناخته شده نیست. مقدار اجزای منفرد تعیین نشده و متغیر است. آبگوشت مغذی، آبگوشت سویای آزمایشگاهی و تزریق قلب مغز، همگی نمونه‌هایی از محیط پیچیده هستند.

به محیط کشت‌هایی که از رشد میکروارگانیسم‌های ناخواسته جلوگیری کرده و با تأمین مواد مغذی و کاهش رقابت از رشد ارگانیسم مورد علاقه حمایت می‌کنند، محیط کشت انتخابی گفته می‌شود. نمونه‌ای از یک محیط انتخابی مک‌مانکی آگار است. این ماده حاوی نمک‌های صفراوی و بنفشه کریستالی است که در رشد بسیاری از باکتری‌های گرم مثبت تداخل ایجاد کرده و رشد باکتری‌های گرم منفی، به ویژه انتروباکتریاسه را ترجیح می‌دهد. این گونه‌ها معمولاً روده‌ای نامیده می‌شوند، در روده زندگی می‌کنند و با وجود نمک‌های صفراوی سازگار هستند. فرهنگ‌های غنی‌سازی رشد ترجیحی یک میکروارگانیسم مورد نظر را که نمایانگر کسری از ارگانیسم های موجود در یک تلقیح است، پرورش می‌دهد.

به عنوان مثال، اگر بخواهیم باکتری‌های تجزیه کننده روغن خام را از باکتری‌های هیدروکربنوکلاستیک را جدا کنیم، خرده کشت‌های پی در پی در محیطی که کربن را فقط به صورت روغن خام تأمین می‌کند، محیط کشت را با باکتری‌های روغن خوار غنی می‌کند. واسطه های تغییر دهنده رنگ کلونی‌ها یا رنگ محیط، تشخیص کلونی‌های باکتری‌های مختلف را آسان می کنند.

تغییرات رنگ نتیجه محصولات نهایی است که در اثر تعامل آنزیم‌های باکتریایی در محیط یا در مورد واکنش‌های همولیتیک، به دلیل لیز سلول‌های قرمز خون در محیط ایجاد می‌شوند. تخمیر کننده‌ها لاکتوز اسیدی تولید می‌کنند که محیط و کلونی‌های تخمیری قوی را به رنگ صورتی گرم در می‌آورد. این ماده با نشانگر pH قرمز خنثی تکمیل می‌شود که در PH کم به صورتی گرم تبدیل می‌شود. محیط‌های انتخابی و افتراقی می‌توانند با هم ترکیب شوند و با شناسایی روش‌های بیوشیمیایی نقش مهمی در شناسایی باکتری‌ها داشته باشند.

اگر به مبحث آزمایشگاه میکروبیولوژی علاقه دارید و به دنبال یادگیری روش‌های مختلف برای میکروب‌شناسی و کشت باکتری هستید، از آموزش زیر استفاده کنید که در آن با انواع روش‌های کشت، تهیه محیط‌های کشت میکروبی، جداسازی، خالص‌سازی و رنگ‌آمیزی گروه‌های مختلف میکروارگانیزم‌ها، راه‌های مقابله و انواع روش‌های کشت میکروارگانیزم‌ها از جمله دیگر اهداف آموزشی این فرادرس است. ضرورت آشنایی با تکنیک‌ها و مباحث آزمایشگاه میکروبیولوژی ۱ در این است که آشنایی اولیه و پایه با خصوصیات میکروارگانیزم‌ها و شناسایی آن‌ها، به فهم و یادگیری بهتر میکروبیولوژی کمک می‌کند.

انواع محیط کشت باکتری چه هستند؟

بر اساس فاکتورهای مختلفی می‌توان محیط کشت باکتری را تقسیم بندی کرد. به طور مثال از نظر بستر محیط کشت سه نوع دارد:

  • محیط کشت جامد: کشت جامد میکروارگانیسم‌های گرما دوست برای کشت‌های ورق جامد میکروارگانیسم‌های گرمادوست نظیر Bacillus acidocaldarius ،Bacillus stearothermophilus ،Thermus aquaticus و Thermus thermophilus و غیره که در دمای 50 تا 70 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کنند، ثابت شده است که صمغ ژلان با شفافیت با اسیل پایین، عامل ژلینگ ترجیحی در مقایسه با آگار برای شمارش یا جداسازی یا هر دو باکتری گرمادوست ارجحیت دارد. محیط مایع را می‌توان با افزودن با حدود 5/1 درصد آگار، ژلی مانند پلی‌ساکارید استخراج شده از جلبک‌های قرمز، جامد کرد که در صورت گرم شدن مایع اما در دمای اتاق جامد است.
  • محیط کشت مایع: اگرچه محیط‌های جامد سال‌ها پایه اصلی در تست‌های آزمایشگاه را تشکیل داده‌اند و هنوز هم در بسیاری از مراکز مورد استفاده قرار می‌گیرند، اما استفاده از محیط‌های مایع مزایای زیادی دارند. مثلا رشد مایکوباکتریوم در محیط مایع به طور قابل توجهی سریع‌تر از محیط جامد است و باعث کاهش تأخیر مرتبط با کشت مایکوباکتری می‌شود. علاوه بر این، میزان جداسازی با استفاده از محیط مایع به ویژه با سیستم‌های کشت باکتری مبتنی بر مایع در دسترس تجاریبه طور کلی بالاتر از محیط جامد است.
  • محیط کشت نیمه جامد: محیط نیمه جامد با غلظت 0/5درصد یا کمتر با آگار تهیه می‌شود. محیط نیمه جامد دارای یک قوام نرم مانند کاستارد است و برای پرورش باکتری‌های میکروآیروفیل یا برای تعیین تحرک باکتری‌ها مفید است.

همچنین انواع مختلفی از روش‌های کشت باکتریایی وجود دارد که براساس نوع باکتری مورد نظر یا نیاز به افتراق گونه‌های مختلف استفاده می‌شوند. به طور کلی محیط کشت باکتری به چهار دسته تقسیم می‌شود:

  • محیط غیر انتخابی غنی شده: برای کشت باکتری‌هایی که در شرایط سخت زندگی می‌کنند. انواع محیط غیر انتخابی غنی شده عبارتند از:
    • بلاد آگار
    • شکلات آگار
    • مولر هینتون آگار
    • تیوگلیکونات براث
  • محیط‌های انتخابی: برای کشت نمونه‌هایی همچون مدفوع، که مخلوطی از  انواع میکروب‌ها در آن‌ها وجود دارند. با افزودن مواد خاصی به محیط کشت می‌توان از رشد سایر باکتری‌ها غیر از باکتری مورد نظر جلوگیری کرد. به عنوان مثال، اگر یک میکروارگانیسم نسبت به آنتی‌بیوتیک خاصی مانند آمپی‌سیلین یا تتراسایکلین مقاوم باشد، می‌توان آن آنتی‌بیوتیک را به محیط اضافه کرد تا از رشد سلول‌های دیگر که مقاومت ندارند، جلوگیری کند. محیط‌های فاقد یک اسید آمینه مانند پرولین در ترکیب با E. coli که قادر به سنتز آن نیست، معمولاً توسط متخصصان ژنتیک قبل از ظهور ژنومیک برای نقشه برداری از کروموزوم‌های باکتریایی استفاده می‌شد.
    از محیط رشد انتخابی همچنین در کشت سلولی برای اطمینان از بقا یا تکثیر سلول‌هایی با خواص ویژه مانند مقاومت به آنتی‌بیوتیک یا توانایی سنتز یک متابولیت خاص استفاده می‌شود. به طور معمول، وجود یک ژن خاص یا آلل یک ژن، توانایی رشد در محیط انتخابی را به سلول می‌دهد. در چنین مواردی، ژن به عنوان مارکر نامیده می‌شود. محیط رشد انتخابی برای سلول‌های یوکاریوتی معمولاً شامل نئومایسین برای انتخاب سلول‌هایی است که با یک پلاسمید حامل ژن مقاومت به نئومایسین به عنوان نشانگر با موفقیت ترانسفکت شده‌اند.
    گانسیکلوویر از این قاعده مستثنی است، زیرا از آن برای از بین بردن سلول‌هایی استفاده می‌شود که نشانگر مربوط به آن، ویروس هرپس سیمپلکس، تیمیدین کیناز را دارند. چهار نوع صفحه آگار بسته به متابولیسم باکتری، رشد افتراقی را نشان می‌دهند. نمونه‌هایی از محیط کشت انتخابی:
    • ائوزین متیلن بلو: حاوی رنگ‌هایی است که برای باکتری‌های گرم مثبت سمی است. این ماده انتخابی و افتراقی برای کلی فرم است.
    • YM (عصاره مخمر، آگار عصاره مالت): دارای PH کم است و از رشد باکتری جلوگیری می‌کند.
    • آگار روده‌ای Hektoen: یک محیط انتخابی و افتراقی برای باکتری‌های گرم منفی روده ای است.
    • محیط انتخابی HIS: نوعی محیط کشت سلولی که فاقد اسید آمینه هیستیدین است.
    • آگار عصاره مخمر ذغال: بافر برای برخی از باکتری‌های گرم منفی به ویژه Legionella pneumophila
    • آگار بیرد – پارکر: برای استافیلوکوک‌های گرم مثبت
    • سابورو دکستروز آگار: به دلیل PH کم (5/6) و غلظت بالای گلوکز (3 تا 4٪) برای برخی قارچ‌ها انتخاب می‌شود.
    • مک‌کانکی آگار: مخصوص باکتری‌های گرم منفی
    • مانیتول سالت آگار: برای باکتری‌های گرم مثبت
    • زایلور لیزین داکسی کلات آگار: برای باکتری‌های گرم منفی
    • ﻟﻮﻧﺸﺘﺎﯾﻦ ﺟﺎﻧﺴﻮن آﮔﺎر: خصوصا برای تشخیص مایکوباکتریوم‌ها استفاده می‌شود.
    • میدل بروک آگار: محیط کشت جامد و مبتنی بر تخم مرغ برای کشت مایکوباکتریوم است.
  • محیط‌های افتراقی: همانند محیط کشت انتخابی برای تشخیص وجود یک باکتری خاص در نمونه کاربرد دارد.
  • محیط‌های اختصاصی: برای تشخیص اختصاصی باکتری‌هایی که در شرایط غیر معمول زندگی می‌کنند یا افتراق آن‌ها از سایر میکروب‌های موجود در نمونه استفاده می‌شود.

در ادامه به انواع محیط کشت باکتری اشاره کرده‌ایم.

صفحات آگار چه هستند؟

کشت‌های میکروبیولوژیکی را می توان در ظروف پتری با اندازه‌های مختلف که دارای لایه نازکی از محیط رشد پایه آگار است، پرورش داد. هنگامی که محیط رشد در ظرف پتری با باکتری‌های مورد نظر تلقیح شد، صفحات در دمای مطلوب برای رشد باکتری‌های انتخاب شده انکوبه می‌شوند (به عنوان مثال معمولاً در 37 درجه سانتیگراد یا دمای بدن انسان، برای کشت از انسان یا حیوانات یا پایین تر برای کشت‌های محیطی). پس از دستیابی به سطح مطلوب رشد، می‌توان صفحات آگار را برای مدت طولانی به صورت وارونه در یخچال نگهداری کرد تا باکتری‌ها را برای آزمایش‌های بعدی نگه دارد.

مواد افزودنی متنوعی وجود دارد که می‌توان قبل از ریختن آگار در بشقاب و اجازه سفت شدن، به آن افزود. برخی از انواع باکتری‌ها فقط در صورت افزودنی‌های خاص می‌توانند رشد کنند. این مورد همچنین می‌تواند در هنگام ایجاد سویه‌های مهندسی شده باکتری‌ها حاوی ژن مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک مورد استفاده قرار گیرد. وقتی آنتی‌بیوتیک انتخاب شده به آگار اضافه شود، فقط سلول‌های باکتریایی حاوی مقاومت ژنتیکی درج ژن قادر به رشد هستند. این اجازه می‌دهد تا محقق فقط کلونی‌هایی را که با موفقیت تغییر شکل داده‌اند انتخاب کند.

قطب‌های پایه آگار نسخه کوچک شده صفحات آگار که در قالب‌های Dipstick اعمال می‌شوند. به عنوان مثال Dip Slide ،Digital Dipstick  پتانسیل استفاده در محل مراقبت را برای اهداف تشخیص نشان می‌دهند. آن‌ها مزایایی نسبت به صفحات آگار دارند مثلا مقرون به صرفه هستند و عملکرد آن‌ها به تخصص یا محیط آزمایشگاهی احتیاج ندارد و امکان استفاده در محل مراقبت را فراهم می‌کند.

محیط کشت بلاد آگار

دو جزء اساسی این نوع محیط کشت عبارتند از:

  • محیط پایه
  • خون از حیواناتی همچون گوسفند، اسب یا خرگوش
  • پپتون
  • عصاره گوشت گاو
  • عصاره مخمر
  • آگار
  • NaCl
  • آب مقطر

برای تکثیر کلونی‌های وسیع‌تری از میکروارگانیسم‌ها می‌توان ترکیبات مکمل دیگری نیز به این محیط افزود. Blood Agar (BA) ماده غنی شده ای است که برای کشت آن دسته از باکتری‌ها یا میکروب‌ها استفاده می‌شود که به راحتی رشد نمی‌کنند. این باکتری‌ها در مقایسه با باکتری‌های معمول نیاز به یک محیط غذایی خاص و غنی شده دارند. Blood Agar برای رشد طیف وسیعی از عوامل بیماری‌زا بخصوص مواردی که رشد آن‌ها دشوارتر است مانند Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae و گونه‌های Neisseria استفاده می‌شود. همچنین برای تشخیص و افتراق باکتری‌های همولیتیک، به ویژه گونه‌های استرپتوکوک مورد نیاز است.

این همچنین یک رسانه افتراقی است که اجازه می‌دهد همولیز (از بین بردن گلبول قرمز) توسط سموم سیتولیتیک ترشح شده توسط برخی از باکتری‌ها مانند سویه‌های خاص باسیلوس، استرپتوکوک، انتروکوک، استافیلوکوک و آئروکوک، ترشح شود. با افزودن آنتی‌بیوتیک، مواد شیمیایی یا رنگ، می‌توان آگار خون را برای برخی عوامل بیماری‌زا انتخابی کرد. به عنوان مثال می‌توان به آگار خون کریستال بنفش برای انتخاب استرپتوکوک پیوژن از سواب گلو و کانامایسین یا آگار خون نئومایسین برای انتخاب بی‌هوازی از چرک اشاره کرد.

موارد استفاده از آگار خونی یک محیط غنی شده با هدف کلی است که اغلب برای رشد ارگانیسم‌های سریع و برای تمایز باکتری‌ها بر اساس خصوصیات همولیتیک آن‌ها (β-همولیز، α-همولیز و γ-همولیز (یا غیر همولیتیک) استفاده می‌شود. درباره همولیز و انواع آن بیشتر بخوانید.

بلاد آگار

محیط کشت شکلات آگار

در واقع نوع تغییر یافته محیط بلاد آگار است که خون یا هموگلوبین به محیط پایه آن اضافه شده است. برخی از گونه‌هایی که روی بلاد آگار رشد نمی‌کنند مانند هموفیلوس را می‌توان در این محیط کشت داد. شکلات آگار (CHOC) یا شکلات آگار خون (CBA)، یک محیط رشد غیر انتخابی و غنی شده است که برای جداسازی باکتری‌های بیماری‌زا استفاده می‌شود. این یک نوع صفحه آگار خون است، حاوی گلبول‌های قرمز خون است که با گرم شدن آرام تا 80 درجه سانتی‌گراد لیز شده است. از شکلات آگار برای رشد باکتری‌های تنفسی سریع استفاده می‌شود مانند Haemophilus influenzae و Neisseria meningitidis.

علاوه بر این، برخی از این باکتری‌ها، به ویژه H-آنفلوانزا، به فاکتورهای رشد مانند نیکوتین آمید آدنین دینوکلئوتید (فاکتور V یا NAD) و همین (فاکتور X) که در داخل گلبول‌های قرمز خون هستند، نیاز دارند. بنابراین، پیش نیاز رشد این باکتری‌ها وجود محلول‌های گلبول قرمز است. گرما همچنین آنزیم‌هایی را غیرفعال می‌کند که در غیر این صورت می‌توانند NAD را تخریب کنند. نام این آگار به دلیل رنگ آن است و حاوی هیچ محصول شکلاتی نیست. آگار شکلاتی با افزودن باسیتراسین برای جنس Haemophilus انتخابی می شود. نوع دیگر آگار شکلاتی به نام آگار Thayer-Martin شامل مجموعه ای از آنتی‌بیوتیک‌ها است که برای گونه‌های Neisseria انتخاب می شود.

شکلات آگار

محیط کشت مولر هنتون آگار

برای تست حساسیت باکتریایی استفاده می‌شود و شامل ترکیباتی از قبیل موارد زیر است:

  • بیف
  • عصاره کازئین
  • نمک‌ها
  • کاتیون‌های دوظرفیتی
  • نشاسته محلول

محیط کشت تیوگلیکولات براث

محیط کشت تایوگلایکولیت (Thioglycollate Broth) برای جداسازی برخی از گونه‌های هوازی و بی‌هوازی استفاده می‌شود و انواع مختلفی از آن وجود دارند اما به طور عمده حاوی ترکیبات زیر هستند:

  • کازئین تجزیه شده
  • گلوکز
  • عصاره مخمر
  • سیستئین
  • تیوگلیکولات سدیم

اگر هدف کشت و جداسازی باکتری بی‌هوازی باشد، افزودن همین و ویتامین K کمک کننده هستند.

کشت تریگلیکولات

محیط کشت مک کانکی آگار

مک‌کانکی آگار (MacConkey Agar) یک محیط کشت انتخابی و افتراقی برای باکتری‌ها است. این ماده برای جداسازی باسیل‌های گرم منفی (که به طور معمول در روده یافت می‌شود) و تفکیک آن‌ها بر اساس تخمیر لاکتوز طراحی شده است. تخمیر کننده‌های لاکتوز روی آگار مک کانکی قرمز یا صورتی می‌شوند و مواد تخمیر کننده تغییر رنگ نمی‌دهند.

این محیط از رشد موجودات گرم مثبت با نمک‌های بنفش و صفرا جلوگیری و امکان انتخاب و جداسازی باکتری‌های گرم منفی را فراهم می‌کند. این محیط با نشانگر pH قرمز خنثی تخمیر لاکتوز را توسط باکتری‌های روده‌ای مشخص خواهد کرد. محیط کشت مک‌کانکی آگار حاوی نمک‌های صفراوی (برای جلوگیری از رشد باکتری‌های گرم مثبت)، رنگ بنفش کریستالی (که برخی از باکتری‌های گرم مثبت را نیز مهار می‌کند) و رنگ قرمز خنثی (که اگر میکروب‌ها لاکتوز را تخمیر کنند صورتی می‌شود) است. ترکیبات آن به طور دقیق‌تر عبارتند از:

  • پپتون
  • پروتئین پپتون
  • لاکتوز
  • نمک‌های صفراوی
  • سدیم کلراید
  • قرمز خنثی
  • بنفش کریستالی
  • آگار
  • آب

و اسیدیته آن حدود ۷/۱ باشد. بسته به نیاز انواع مختلفی از مک‌کانکی آگار وجود دارد. در صورت عدم نیاز به گسترش گونه‌های پروتئوس، کلرید سدیم حذف می‌شود. بنفش کریستالی در غلظت 0001/0 درصد (001/0 گرم در لیتر) در صورت نیاز به بررسی مهار باکتری‌های گرم مثبت در آن گنجانده شده است. مک‌کانکی آگار با سوربیتول برای جداسازی E. coli O157، یکی از پاتوژن‌های روده استفاده می‌شود.

با استفاده از نشانگر pH خنثی قرمز، آگار آن دسته از باکتری‌های گرم منفی را که می‌توانند لاکتوز قند (Lac +) را تخمیر کنند از آن‌هایی که نمی‌توانند تخمیر انجام دهند (Lac -)، متمایز می‌کند. این محیط به عنوان محیط شاخص و محیط کشتی با قدرت انتخاب کم نیز شناخته می‌شود. وجود نمک‌های صفراوی ازدحام گونه‌های پروتئوس را مهار می‌کند.

مک کانکی آگار

محیط کشت مانیتول سالت آگار

مانیتول نمک آگار یا MSA یک محیط رشد انتخابی و افتراقی است که معمولاً در میکروب‌شناسی مورد استفاده قرار می‌گیرد و رشد گروهی از باکتری‌های خاص را تقویت می‌کند در حالی که جلوی رشد سایر آن‌ها را می‌گیرد. این محیط به عنوان یکی از روش‌های تشخیص میکروب‌های بیماری‌زا در مدت زمان کوتاه در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی اهمیت دارد. محیط کشت مانیتول سالت آگار حاوی غلظت زیاد (حدود 7/5–10٪) نمک (NaCl) است که برای اکثر باکتری‌ها مهار کننده است.

وجود این غلظت از نمک باعث می‌شود MSA در برابر بیشتر باکتری‌های گرم منفی انتخابی و برای برخی از باکتری‌های گرم مثبت (استافیلوکوک، انتروکوک و میکروکوکاسه) قابل تحمل باشد. همچنین یک واسطه افتراقی برای استافیلوکوک‌های تخمیر کننده، مانیتول است، مانیتول کربوهیدرات و اندیکاتور قرمز، یک شاخص pH برای تشخیص اسید تولید شده توسط استافیلوکوک‌های تخمیر کننده مانیتول هستند.

استافیلوکوکوس اورئوس کلونی‌های زرد با مناطق زرد تولید می‌کند، در حالی که سایر استافیلوکوک‌های منفی کوآگولاز کلنی های کوچک صورتی یا قرمز تولید می‌کنند و هیچ تغییری در رنگ محیط ایجاد نمی‌کنند. اگر ارگانیسم بتواند مانیتول را تخمیر کند، یک محصول جانبی اسیدی ایجاد می‌شود که باعث زرد شدن فنل قرمز موجود در آگار می‌شود. این محیط برای جداسازی انتخابی گونه‌های استافیلوکوک در بیماری احتمالی (pp) کاربرد دارد.

ترکیبات سازنده این محیط به طور کلی عبارتند از:

  • آنزیم کازئین
  • آنزیمی هضم کننده بافت حیوانی
  • عصاره گوشت گاو
  • D- مانیتول
  • کلرید سدیم
  • قرمز فنول
  • آگار

در اسیدیته حدود ۷/۴ و دمای 25 درجه سانتی‌گراد

محیط کشت XLD آگار

آگار دی اکسی کولات (XLD agar) یک محیط رشد انتخابی است که در جداسازی گونه‌های سالمونلا و شیگلا از نمونه‌های بالینی و مواد غذایی مورد استفاده قرار می‌گیرد. PH آن تقریباً 7/4 است و به دلیل شاخص قرمز، صورتی یا قرمز روشن دارد. تخمیر شکر pH را کاهش می‌دهد و نشانگر قرمز فنول با تغییر به زرد این را ثبت می‌کند. بیشتر باکتری‌های روده  از جمله سالمونلا، می‌توانند قند زایلوز را تخمیر کرده و اسید تولید کنند. مستعمرات شیگلا نمی‌توانند این کار را انجام دهند و بنابراین قرمز باقی می‌مانند.

کلونی‌های سالمونلا پس از خسته شدن منبع گزیلوز، لیزین را دکربوکسیل می‌کنند، pH را یک بار دیگر به قلیایی افزایش می‌دهند و از کلنی‌های قرمز شیگلا تقلید می‌کنند. سالمونلا تیوسولفات را متابولیزه کرده و سولفید هیدروژن تولید می‌کند که منجر به تشکیل کلونی‌هایی با مراکز سیاه می‌شود و به آن‌ها اجازه می‌دهد از کلونی‌های شیگلا با رنگ مشابه متفاوت شوند.

انتروباکتری‌های دیگر مانند E. coli لاکتوز موجود در محیط را تا حدی تخمیر می‌کنند که با برگشت کربوکسیلاسیون از برگشت pH جلوگیری کرده و محیط را به زردی اسیدی کند. تغییرات این محیط کشت در صورت وجود گونه‌های ختلف به ترتیب زیر است:

  • گونه‌های سالمونلا: کلونی های قرمز، بعضی از آن‌ها دارای مراکز سیاه هستند. آگار به دلیل وجود کلونی‌های نوع سالمونلا قرمز خواهد شد.
  • گونه های شیگلا: کلونی‌های قرمز
  • کلی‌فرم: کلونی‌های زرد تا نارنجی
  • سودوموناس آئروژینوزا: کلونی‌های صورتی و سختی ایجاد می‌کند. این نوع کلونی به دلیل شباهت‌های رنگی به راحتی می‌تواند با سالمونلا اشتباه گرفته شود.

xld آگار

محیط کشت لونشتین جنسون

محیط کشت لونشتین جنسون (Löwenstein–Jensen medium) یا LJ، یک محیط رشد است که به ویژه برای کشت گونه های مایکوباکتریوم، به ویژه مایکوباکتریوم سل استفاده می‌شود. هنگامی که در محیط LJ رشد می‌یابد، M. tuberculosis به صورت دانه‌های قهوه‌ای ظاهر می‌شود (که گاهی اوقات بوف، خشن و سخت نامیده می‌شود) این محیط باید به دلیل کم شدن زمان دو برابر شدن M. tuberculosis (15-20 ساعت) در مقایسه با سایر باکتری‌ها، برای مدت زمان قابل توجهی انکوبه شود.

  • ترکیب معمول متناسب با M. tuberculosis
  • سبز مالاکیت
  • گلیسرول
  • آسپاراژین
  • نشاسته سیب زمینی
  • تخم مرغ لخته شده
  • محلول نمک معدنی پتاسیم
  • دی هیدروژن فسفات
  • سولفات منیزیم
  • سدیم سیترات

فرمول اصلی شامل نشاسته بود که بعداً مشخص شد غیرضروری است، بنابراین حذف شد. مقادیر کم پنی‌سیلین و نالیدیکسیک اسید نیز در محیط LJ وجود دارد تا از رشد باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی جلوگیری کند تا رشد فقط به گونه‌های مایکوباکتریوم محدود شود. وجود رنگ سبز مالاکیت در محیط باعث مهار اکثر باکتری‌های دیگر می‌شود.

با فرآیند بازبینی ضد عفونی و جامد می شود. وجود گلیسرول رشد M. tuberculosis را افزایش می‌دهد. اگر دامنه‌ها روی لوله‌های آزمایشگاهی ساخته شده باشند، باید در سرما نگهداری شوند و ظرف یک ماه استفاده شوند. برای کشت M.bovis، گلیسرول حذف شده و سدیم پیروات اضافه می‌شود. محیط به نظر می‌رسد سبز، مات و مبهم است.

تشخیص عفونت‌های مایکوباکتریایی برای آزمایش حساسیت آنتی‌بیوتیکی جدا شده‌ها برای تمایز گونه‌های مختلف مایکوباکتریوم (توسط مورفولوژی کلونی، سرعت رشد، ویژگی‌های بیوشیمیایی و میکروسکوپ) است.

این محیط کشت به دو صورت جامد و مایع قابل استفاده است. محیط کشت LJ جامد انواع زیر هستند:

  • مبتنی بر تخم مرغ، محیط پتراگنانی و محیط دورست (Dorset)
  • آگار میدل بروک 7H10
  • آگار میدل بروک 7H11
  • مبتنی بر خون – محیط Tarshis
  • مبتنی بر سرم – محیط لوفلر
  • مبتنی بر سیب‌زمینی – محیط Pawlowsky

انواع محیط کشت LJ مایع نیز شامل موارد زیر هستند:

  • محیط کشت دوبوس (Dubos’ medium)
  • پروسکاور و محیط کشت بکس (Proskauer and Beck’s medium)
  • آبگوشت میدبروک 7H9
  • محیط کشت سولا (Sula’s medium)
  • محیط کشت سوتون (Sauton’s medium)

محیط کشت لونشتین جنسون

محیط کشت میدل بروک آگار

محیط کشت باکتری میدل بروک آگار (Middlebrook 7H10 Agar) یک محیط رشد جامد است که مخصوصاً برای کشت مایکوباکتریوم خصوصاً مایکوباکتریوم سل استفاده می‌شود. گزارش شده است که محیط 7H10 نسبت به محیط مبتنی بر تخم مرغ که معمولاً برای پرورش مایکوباکتریوم استفاده می‌شود، آلودگی کمتری رشد می‌کند. مواد تشکیل دهنده آن عبارتند از:

  • سولفات آمونیوم
  • مونو پتاسیم فسفات
  • دی سدیم فسفات
  • سدیم سدیم
  • سولفات منیزیم
  • سولفات روی
  • سولفات مس
  • ال-گلوتامیک اسید
  • سدیم آمونیوم فریک
  • پیریدوکسین هیدروکلراید
  • بیوتین
  • سبز مالاکیت
  • آگار
  • کلرید کلسیم

محیط کشت باید طی 5-7 روز پس از تلقیح و هفته‌ای یک بار پس از آن تا 8 هفته خوانده شوند.

محیط کشت میدل بروک آگار

محیط کشت سابورو دکستروز آگار

Sabouraud Dextrose Agar (SDA) برای جداسازی، کشت و نگهداری گونه‌های غیر بیماری‌زا و بیماری‌زا از قارچ‌ها و مخمرها و همچنین باکتری‌های اسیدوفیل استفاده می‌شود. SDA توسط Sabouraud در سال 1892 برای کشت درماتوفیت‌ها فرموله شد. PH به منظور افزایش رشد قارچ‌ها به ویژه درماتوفیت‌ها و جلوگیری از رشد باکتری در نمونه‌های بالینی تقریباً به 5/6 تنظیم می‌شود. این محیط کشت انواع مختلفی دارد که در هرکدام جزئی به محیط اضافه یا کم می‌شود اما به طور کلی اجزای سازنده آن عبارتند از:

  • دکستروز (گلوکز)
  • پپتون: پپتون (هضم آنزیمی کازئین و هضم آنزیمی بافت حیوانات) منبع نیتروژن و ویتامین مورد نیاز برای رشد ارگانیسم در SDA را تأمین می‌کند. دکستروز به عنوان منبع انرژی و کربن اضافه می‌شود. آگار ماده جامد کننده است.
  • آگار
  • آب مقطر

از جمله کاربردهای این محیط کشت باکتری می‌توان موارد زیر را برشمرد:

  • کشت انتخابی مخمرها، کپک‌ها و باکتری‌های اسیدی
  • همراه با آنتی‌بیوتیک‌ها برای جداسازی قارچ‌های بیماری‌زا از مواد حاوی تعداد زیادی قارچ یا باکتری دیگر
  • تعیین آلودگی میکروبی در مواد غذایی، آرایشی و بهداشتی و نمونه‌های بالینی

سابورو دکستروز آگار

محیط کشت ستریماید آگار

ستریماید آگار نوعی آگار است که برای جداسازی انتخابی باکتری گرم منفی، سودوموناس آئروژینوزا استفاده می شود. همانطور که از نام آن پیداست، حاوی «ستریماید» (Cetrimide) است که عامل انتخابی علیه فلور میکروبی جایگزین است. ستریماید همچنین تولید رنگدانه های سودوموناس مانند پیوسیانین و پیووریدین را افزایش می‌دهد که به ترتیب رنگ مشخصی به رنگ سبز آبی و زرد سبز دارند. آگار ستریماید به طور گسترده‌ای در بررسی محصولات آرایشی، دارویی و بالینی برای آزمایش وجود سودوموناس آئروژینوزا استفاده می‌شود.

اجزای این محیط کشت باکتری عبارتند از:

  • ژلاتین هضم لوزالمعده: مواد مغذی لازم برای P. aeruginosa مانند نیتروژن، ویتامین‌ها و کربن را تأمین می‌کند.
  • پتاسیم سولفات
  • منیزیم کلراید
  • گلیسرول: به عنوان منبع کربن
  • آگارسیتیل تری متیل آمونیوم برومید
  • آب مقطر

این محیط کشت باکتری در موارد زیر کاربرد دارد:

  • جداسازی انتخابی و شناسایی احتمالی سودوموناس آئروژینوزا از نمونه‌های بالینی و غیر بالینی
  • تعیین توانایی ارگانیسم در تولید فلورسئین و پیوسیانین (آنتی‌بیوتیک)

مانند همه روش‌های دیگر برای کشت باکتری محیط کشت ستریماید آگار نیز با محدودیت‌هایی روبرو است:

  • گاهی اوقات محیط به رنگ زرد کمرنگ در می‌آید. با این حال، این رنگ‌آمیزی به راحتی انجام می‌شود و از تولید فلورسئین متمایز می‌شود زیرا این زردی فلورس نمی‌کند.
  • برخی از اسپورهای غیر تخمیری و اسپورداران هوازی ممکن است رنگدانه‌های برنز قهوه‌ای محلول در آب را در این محیط نشان دهند. سویه‌های Serratia ممکن است رنگدانه‌ای صورتی نشان دهند.
  • مطالعات Lowbury و Collins نشان داد که P. aeruginosa اگر این کشت‌ها برای مدت کوتاهی در دمای اتاق بمانند، می‌تواند در اثر اشعه ماورا بنفش، فلورسانس خود را از دست بدهد و هنگام انکوبه کردن مجدد دوباره فلورسانس را از خود نشان دهند.
  • برای تأیید P. aeruginosa آزمایشات بیشتری لازم است.

سیمون سیترات

محیط کشت برد پارکر آگار

آگار بیرد – پارکر  (Baird-Parker Agar) نوعی آگار است که برای جداسازی انتخابی گونه‌های گرم مثبت استافیلوکوک استفاده می‌شود. این ماده حاوی لیتیوم کلراید و تلوریت است تا از رشد فلور میکروبی جایگزین جلوگیری کند، در حالی که پیروات و گلایسین موجود باعث رشد استافیلوکوک می‌شود. کلونی‌های استافیلوکوک به رنگ سیاه با مناطق روشن ایجاد شده در اطراف خود نشان می‌دهند.

پارکر آگار

محیط کشت باکتری (TCBS) آگار

نمک تیوسولفات – سیترات – صفراوی – ساکاروز یا به اختصار TCBS Agar نوعی محیط کشت باکتری برای جداسازی انتخابی ویبرای وبا و Vibrio parahaemolyticus از انواع نمونه‌های بالینی و غیر بالینی استفاده می‌شود. گونه‌های ویبریو به دلیل نقش خود در عفونت‌های روده‌ای انسان مانند وبا و اسهال V. parahaemolyticus به طور گسترده‌ای شناخته شده‌اند. تمام گونه‌های بیماری‌زای Vibrio، به جز Vibrio hollisae، در TCBS Agar رشد می‌کنند. فرمول اصلی ساخته شده توسط ناکانیشی متعاقباً توسط کوبایاشی و همکاران اصلاح شده است. برای جداسازی انتخابی گونه‌های ویبریوی بیماری‌زا ترکیب TCBS Agar عبارت است از مواد زیر:

  • ساکاروز
  • دیپپتون
  • سدیم سیترات
  • سدیم تیوسولفات
  • کلرید سدیم
  • عصاره مخمر
  • Oxbile (Oxgall)
  • کولات سدیم
  • فریک سیترات
  • بروموتیمول آبی
  • تیمول بلو
  • آگار

pH نهایی 8/6 و دما در 25 درجه سانتی‌گراد هستند. TCBS Agar برای جداسازی انتخابی ویبریو وبا و سایر ویبرهای انتروپاتوژنیک استفاده می‌شود. تیوسولفات و سدیم سیترات و همچنین قلیایی بودن محیط به طور قابل توجهی مانع رشد انتروباکتری‌ها می‌شوند. صفراوی و کلات سدیم رشد انتروکوک‌ها را کند کرده و از رشد باکتری‌های گرم مثبت جلوگیری می‌کنند. اسیدی شدن محیط حاصل از تخمیر ساکارز توسط ویبریو باعث می‌شود تا آبی برومیتمول زرد شود. Bromthymol Blue و Thymol Blue شاخص‌های pH هستند.

با استفاده از تیوسولفات به عنوان منبع گوگرد، تولید سولفید هیدروژن در حضور سیترات فریک تجسم می‌یابد. عصاره مخمر و پپتون نیتروژن، ویتامین‌ها و اسیدهای آمینه موجود در TCBS Agar را تأمین می‌کند. کلرید سدیم رشد مطلوب و فعالیت متابولیکی گیاه هالوفیلیک ویبریو را فراهم می‌کند. آگار یک ماده جامد کننده است. از PH افزایش یافته برای افزایش رشد ویبریو وبا استفاده می‌شود، زیرا این ارگانیسم به محیط اسیدی حساس است. موارد استفاده از TCBS Agar برای جداسازی ویبریو وبا و سایر ویبریو انتروپاتولوژیک (به ویژه ویبریو پاراهامولیتیکوس) در ماهی، غذاهای دریایی و نمونه‌های بیولوژیکی از منشا حیوانی استفاده می‌شود. از آگار TCBS همچنین برای کنترل شیوع تاج خارها استفاده شده است (آکانتاستر

محدودیت‌های TCBS Agar نیز عبارتند از:

  • به دلیل تنوع تغذیه‌ای، ممکن است برخی از سویه‌ها دیده شوند که رشد ضعیفی دارند یا در این محیط رشد نمی‌کنند.
  • آزمایشات بیشتر برای تأیید Vibrio spp لازم است.
  • در انزوای اولیه، V. parahaemolyticus ممکن است با Aeromonas hydrophila ، Plesiomonas shigelloides و Pseudomonas spp اشتباه گرفته شود.
  • Proteus spp با تخمیر ساکارز لکه‌های زرد تولید کنید که ممکن است شبیه به ویبریو باشد.
  • TCBS یک محیط رضایت‌بخش برای آزمایش اکسیداز گونه های Vibrio است.
  • به دلیل تأخیر در تخمیر ساکارز، ممکن است چند سویه V. کلرا در TCBS Agar سبز یا بی‌رنگ به نظر برسند.

توصیه می‌شود از یک محیط غیر انتخابی همراه با محیط انتخابی برای بازیابی بهینه ارگانیسم‌های بیماری‌زا استفاده شود.

TCBS آگار

محیط کشت آگار مغذی

Nutrient Agar یک ماده غذایی عمومی هدف کلی است که برای پرورش میکروب‌ها از رشد طیف وسیعی از ارگانیسم های غیر سریع استفاده می کند. آگار مغذی محبوب است زیرا می‌تواند انواع مختلفی از باکتری‌ها و قارچ‌ها را رشد دهد و حاوی بسیاری از مواد مغذی مورد نیاز برای رشد باکتری‌ها است. ترکیب مواد مغذی آگار بارتند از:

  • پپتون هضم آنزیمی پروتئین حیوانی: پپتون منبع اصلی نیتروژن آلی برای باکتری‌های در حال رشد است.
  • عصاره گوشت گاو / عصاره مخمر: این مواد محلول در آب، به رشد باکتری کمک می‌کنند و حاوی ویتامین‌ها، کربوهیدرات‌ها، ترکیبات آلی نیتروژن و نمک‌ها هستند.
  • آگار که ماده جامد کننده است.
  • NaCl: وجود کلرید سدیم در مواد غذایی آگار غلظت نمکی را در محیط حفظ می‌کند که مشابه سیتوپلاسم میکروارگانیسم‌ها است.
  • آب مقطر: برای رشد و تولید مثل میکروارگانیسم‌ها ضروری است و همچنین محیطی را فراهم می‌کند که از طریق آن مواد مغذی مختلفی منتقل شود.

pH در دمای 25 درجه سانتیگراد، به حالت خنثی (7/4) تنظیم می‌شود.

کابردهای این محیط کشت عبارتند از:

  • جداسازی و تصفیه محیط کشت‌ها
  • ابزاری برای تولید محیط‌های باکتریایی مورد نیاز آزمایشات حساسیت آنتی‌بیوتیکی مورد استفاده قرار می‌گیرند. در واقع، تست حساسیت به آنتی‌بیوتیک معمولاً بر روی محیط‌هایی انجام می‌شود که مخصوصاً برای آن منظور فرموله شده‌اند.

محیط کشت باکتری غنی شده

محیط غنی شده حاوی مواد مغذی مورد نیاز برای حمایت از رشد طیف گسترده‌ای از ارگانیسم‌ها، از جمله برخی از موجودات سریع‌تر است. آن‌ها معمولاً برای برداشت انواع مختلف میکروب که در نمونه وجود دارد، مورد استفاده قرار می‌گیرند. آگار خون یک ماده غنی شده است که در آن خون کامل مغذی غنی از مواد مغذی، مواد مغذی اساسی را مکمل می‌کند. آگار شکلاتی با خون تحت عملیات حرارتی (40-45 درجه سانتیگراد یا 104 تا 113 درجه فارنهایت) غنی شده است که قهوه‌ای می‌شود و رنگی را که برای آن نامگذاری شده به محیط می‌دهد.

محیط کشت غنی شده

محیط کشت براث

یکی از روش‌های کشت باکتریایی، کشت مایع است که در آن باکتری‌های مورد نظر در یک ماده مغذی مایع مانند Luria Broth در یک گلدان عمودی معلق می‌شوند. این اجازه می‌دهد تا یک دانشمند مقدار زیادی باکتری را برای انواع کاربردهای پایین دستی پرورش دهد.

محیط کشت باکتری مایع ایده‌آل برای تهیه روش ضد میکروبی است که در آن آزمایشگر مایع را با باکتری تلقیح می کند و اجازه می دهد یک شب رشد کند (ممکن است از آن‌ها برای رشد یکنواخت استفاده کنند). سپس مقدار نمونه را برای آزمایش فعالیت ضد میکروبی یک دارو یا پروتئین خاص (پپتیدهای ضد میکروبی) می‌گیرند. میکروب‌شناس ممکن است تصمیم بگیرد از کشت مایع ساکن استفاده کند. این کشت‌ها شیب اکسیژن را برای میکروب‌ها فراهم می‌کنند.

محیط کشت اختصاصی birdseed agar

برای جداسازی Cryptococcus neoformans یک محیط کشت باکتری از نوع جامد است که برای جداسازی انتخابی و افتراقی Cryptococcus neoformans از نمونه‌های بالینی استفاده می شود. Cryptococcus neoformans یک مخمر کپسول‌دار است که آنزیم فنولوکسیداز را تولید می‌کند، آنزیمی که در سنتز ملانین لازم است. کلونی‌های رنگی قهوه‌ای Cryptococcus neoformans در سال 1962 وقتی استایب کشت مخمر را روی محیط حاوی بذرهای Guizotia abyssinica رشد داد، توسط استایب مشاهده شد.

بعدا مشخص شد که دانه‌های حاوی اسید کافئیک هستند که به عنوان بستر تولید‌کننده ملانین عمل می‌کند. در سال 1966، Shields و Ajello با انتخاب ماده متوسط ​​با افزودنی ضد میکروبی، Staib’s Birdseed Agar را اصلاح کردند. همچنین با نام‌های Caffeic Acid Agar یا Niger Seed Agar یا Staib Agar شناخته می‌شود. این روش کشت باکتری محدودیت‌های تشخیصی نیز دارد که عبارتند از:

  • سویه‌های نادر نئوفرمن‌ها ممکن است کلونی‌های رنگی تولید نکنند.
  • نمونه‌هایی که به شدت آلوده به باکتری هستند ممکن است رشد و یا رنگدانه نئوفرمن‌ها را پنهان کنند.
  • اورئوبازیدیوم، Sporothrix ،Wangiella و Phialophora ممکن است کلونی‌های قهوه‌ای تیره ایجاد کنند اما این رنگدانه نتیجه فعالیت آنزیمی که با ایجاد رنگ‌دانه در کلونی‌ها در همه محیط کشت‌ها مشخص می‌شود، نیست.

birdseed agar

محیط کشت پلیت آگار شمارشی

Plate Count Agar (PCA) که به آن Standard Methods Agar (SMA) نیز گفته می‌شود، یک روش کمی و محیط رشد میکروبیولوژیکی است که معمولاً برای ارزیابی یا نظارت بر رشد باکتریایی کل یا زنده نمونه مورد استفاده قرار می‌گیرد. PCA یک رسانه انتخابی نیست. ترکیب آگار تعداد صفحات ممکن است متفاوت باشد اما معمولاً حاوی ترکیبات زیر است:

  • پپتون
  • عصاره مخمر
  • گلوکز
  • آگار

pH به مدت 48 ساعت در 32 درجه سانتی‌گراد به حالت خنثی تنظیم می‌شود.

انواع روش های کشت باکتری چه هستند؟

براساس نیازهای باکتری یا هدف از انجام تست، متدها یا روش‌های متنوعی برای کشت باکتری وجود دارند که در ادامه توضیح داده شده‌اند.

کشت عمودی باکتری

کشت‌ باکتری به روش عمودی مانند محیط کشت آگار هستند، اما توسط آگار جامد در یک لوله آزمایش ایجاد می‌شوند. باکتری‌ها از طریق سوزن تلقیح یا نوک پیپت که در مرکز آگار زده می‌شود، وارد می‌شوند. باکتری‌ها در ناحیه سوراخ شده رشد می‌کنند. کشت‌های عمودی معمولاً برای ذخیره یا حمل و نقل کوتاه مدت فرهنگ استفاده می‌شود.

کشت باکتری در ظروف لرزان

در ظروف لرزان (shake flask) برای اطمینان از هوادهی و در دسترس بودن اکسیژن و مواد مغذی و همچنین جلوگیری از نشست باکتری‌ها در قسمت پایین فلاسک که منجر به مرگ سلول‌ها در اثر عدم وجود مواد مغذی می‌شود بنابراین باید کشت مایعات باکتریایی همیشه لرزشی باشد. این روش برای افتراق باکتری‌های بی‌هوازی کاربرد دارد.

کشت پیروپلیت باکتری

کشت باکتری به روش پیورولیت نوعی کشت عمقی است. در طبیعت جمعیت میکروبی بر اساس گونه‌ها جدا نمی‌شوند بلکه با مخلوطی از انواع سلول‌های دیگر وجود دارد. این محیط‌ها فقط حاوی یک نوع ارگانیسم هستند و برای مطالعه خواص، ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی آن‌ها مناسب است. در بعضی مواقع نیز تعیین سلول‌های زنده در بسیاری از مراحل میکروبیولوژیک بسیار مهم است.

برای رسیدن به این هدف، از روش صفحه رقت – آگار سریال استفاده می‌شود. به طور خلاصه، این روش شامل شیب رقت سوسپانسیون باکتریایی در آب استریل است که به عنوان رقیق‌کننده حجم شناخته شده عمل می‌کنند. پس از رقیق شدن، سوسپانسیون‌ها روی محیط‌های غذایی مناسب قرار می‌گیرند.

  • روش پورپلیت به یک شیب رقت از کشت مخلوط با استفاده از حلقه یا پیپت نیاز دارد.
  • آگار مذاب که در دمای 45 درجه سانتیگراد خنک شود، در ظرف پتری ریخته می‌شود که حاوی مقدار مشخصی از نمونه رقیق شده است.
  • پس از افزودن آغار مذاب و سپس خنک شده، پوشش تعویض می‌شود و صفحات به آرامی با یک حرکت دورانی می چرخند تا توزیع یکنواخت میکروارگانیسم‌ها حاصل شود.
  • این روش برای همه رقت‌ها تکرار می‌شود.
  • رقت‌ها برای دقت بیشتر باید در دولایه انجام و یک شب انکوباتور شوند و روی یک پیشخوان یا با دست یا با نسخه اصلاح شده الکترونیکی شمارش شوند.
  • اگر ماده مورد آزمایش یک مایع آبی باشد، حجم مشخصی به سادگی در قاعده ظرف پتری قرار می‌گیرد و 10 – 25 میلی‌لیتر محیط کشت مذاب (به طور معمول آگار سویا تریپتون یا آگار تعداد صفحه در دمای 45 درجه سانتیگراد) روی آن ریخته و با چرخش آرام به سرعت مخلوط می‌شود، سپس صفحه را در یک طرف قرار می‌دهیم تا آگار پخته شود.
  • اگر نمونه جامد و در آب محلول باشد، آن ماده جامد بصورت نرمال حل می‌شود، اما اگر نامحلول باشد، از سوسپانسیون استفاده می شود. مشکل در مورد آخر این خواهد بود که اطمینان حاصل کنید در هنگام پیپت و هر مرحله رقت، سیستم تعلیق به طور یکنواخت پراکنده می‌شود.
  • از آنجا که نمونه قبل از غوطه‌وری ژل در محیط پخش می‌شود، کلونی‌هایی که رشد می‌کنند به همین ترتیب در سراسر آگار پراکنده می‌شوند. در نتیجه، کلونی‌ها معمولاً از اندازه‌های مختلفی برخوردارند زیرا اکسیژن موجود در ژل کمتر از سطح آن است و اکثر ارگانیسم‌ها هوازی سخت یا بی‌هوازی غیر عادی هستند که در جایی که غلظت اکسیژن بیشتر باشد، بهترین رشد را خواهند داشت.

این روش کشت باکتری برای انجام شمارش مناسب صفحات که در آن تعداد کل واحدهای تشکیل دهنده کلنی درون آگار و سطح آگار بر روی یک صفحه واحد شمرده می‌شود، کاربرد دارد. تعداد صفحات قابل قبول برای تولید منحنی رشد، محاسبه غلظت سلول در لوله‌ نمونه و همچنین بررسی تأثیر محیط‌های مختلف یا شرایط رشد بر بقای سلول باکتریایی یا میزان رشد، وسیله استانداردی را در اختیار دانشمندان قرار می‌دهد.

انجام این روش کشت باکتری آسان است. به دلیل حجم نمونه بیشتر، غلظت های کمتری نسبت به روش پخش سطح را تشخیص می‌دهد و نیازی به خشک شدن قبل از سطح آگار ندارد. متداول‌ترین روش برای تعیین تعداد کل زنده، روش پورپلیت است. برای تعیین تعداد میکروب در میلی لیتر در یک نمونه می‌توان از روش صفحه ورق استفاده کرد. این مزیت عدم نیاز به صفحات تهیه شده قبلی است و اغلب برای سنجش آلودگی باکتریایی مواد غذایی استفاده می‌شود.

کشت ایزوله باکتری

برای جدا کردن میکروب از جمعیت طبیعی و میکروب‌های زنده، همان‌طور که در محیط وجود دارد، به عنوان مثال در گیاهان آب، خاک یا از موجودات زنده با فلور پوست، فلور دهان یا فلور روده، باید آن را از مخلوط به طور سنتی میکروب‌ها برای شناسایی میکروب‌های مورد علاقه بر اساس ویژگی‌های رشد آن کشت می‌شوند. بسته به تراکم مورد انتظار و زنده ماندن میکروب های موجود در یک نمونه مایع، روش‌های فیزیکی برای افزایش شیب به عنوان مثال رقت سریال یا سانتریفیوژ ممکن است انتخاب شود.

این روش کشت باکتری به منظور جداسازی ارگانیسم‌ها در مواد با محتوای میکروبی بالا مانند فاضلاب، خاک یا مدفوع، رقت‌های سریال احتمال جداسازی مخلوط را افزایش می‌دهد. در یک محیط مایع با ارگانیسم‌های اندک یا بدون ارگانیسم‌های مورد انتظار، از ناحیه‌ای که به طور معمول استریل است (مانند CSF، خون درون سیستم گردش خون) سانتریفیوژ با تزریق ماده مایع رویی و استفاده از تنها رسوبات احتمال رشد و جداسازی باکتری‌ها یا معمولاً ویروس‌های مرتبط با سلول اگر کسی انتظار ارگانیسم سریع خاصی را داشته باشد، باید محیط کشت ایزوله را برای رشد ارگانیسم مورد نظر آماده کرد.

به عنوان مثال، باکتری که در معرض هوا از بین می‌رود، تنها در صورت حمل و پردازش نمونه در شرایط بدون هوا یا بی‌هوازی قابل جدا شدن است. یک باکتری که در اثر قرار گرفتن در معرض دمای اتاق از بین می رود (گرمادوست) به یک ظرف حمل و نقل از قبل گرم شده احتیاج دارد و میکروبی که هنگام حمل آن بر روی یک سواب پنبه خشک می‌شود و می‌میرد، قبل از کشت موفقیت آمیز به یک محیط انتقال ویروسی نیاز دارد.

کشت ایزوله باکتری

کشت خطی باکتری

کشت باکتری به روش خطی سریع و در حالت ایده آل یک فرایند ساده از رقت‌سازی است. این روش با رقیق‌سازی غلظت نسبتاً زیاد باکتری به غلظت کمتر انجام می‌شود. کاهش باکتری‌ها باید نشان دهد که کلونی‌ها به اندازه کافی از هم جدا شده‌اند تا بر جدایی انواع مختلف میکروب‌ها تأثیر بگذارد. کشت خطی با استفاده از یک ابزار استریل مانند سواب پنبه یا معمولاً یک حلقه تلقیح انجام می‌شود. تکنیک‌های اسپتیک برای حفظ فرهنگ میکروبیولوژیک و جلوگیری از آلودگی محیط رشد استفاده می‌شوند. انواع مختلفی از روش‌ها وجود دارد که برای سویه‌های مختلف استفاده می‌شود و می‌تواند به تعداد میکروب‌های نمونه بستگی داشته باشد.

الگوی خطی سه فاز که به T-Streak معروف است، برای مبتدیان توصیه می‌شود. رگه گذاری با استفاده از یک ابزار استریل مانند یک سواب پنبه یا معمولاً یک حلقه تلقیح انجام می‌شود. حلقه تلقیح ابتدا با عبور از شعله عقیم می‌شود. وقتی این حلقه خنک است، درون مایه تلقیحی مانند آبگوشت یا نمونه بیمار قرار می‌گیرد که حاوی بسیاری از گونه‌های باکتری است. سپس حلقه تلقیح با حرکت زیگزاگی به سطح آگار به عقب و جلو کشیده می‌شود تا اینکه تقریباً 30٪ از صفحه پوشانده شود.

سپس حلقه مجدداً عقیم شده و صفحه 90 درجه چرخانده می‌شود. با شروع از قسمت رگه دار شده قبلی، حلقه دو تا سه بار از طریق آن کشیده می‌شود و الگوی زیگزاگ را ادامه می‌دهد. این روش یک بار دیگر با احتیاط تکرار می‌شود تا به بخش‌های رگه دار قبلی دست نزنید. هر بار این حلقه تعداد باکتری‌های کمتری را جمع می‌کند تا اینکه سلول‌های باکتریایی منفرد را که می‌توانند به یک کلنی تبدیل شوند، جمع کند. صفحه باید در بخش اول بیشترین رشد را نشان دهد. بخش دوم رشد کمتری و چند کولنی جدا شده دارند، در حالی که قسمت آخر کمترین رشد و تعداد زیادی کلونی جدا شده را خواهد داشت.

نمونه در یک ربع ظرف پتری که حاوی محیط رشد است پخش می‌شود. باکتری‌ها برای رشد به مواد مغذی مختلفی احتیاج دارند که شامل آب، منبع انرژی، منابع کربن، گوگرد، ازت، فسفر، برخی مواد معدنی و سایر ویتامین‌ها و فاکتورهای رشد است. یک نوع بسیار رایج که در آزمایشگاه‌های میکروبیولوژی استفاده می‌شود، آگار یک ماده ژلاتینی مشتق شده از جلبک دریایی است. ماده غذایی آگار دارای بسیاری از مواد تشکیل‌دهنده با مقادیر نامشخص مواد مغذی در آن‌ها است.

از یک طرف، این می‌تواند یک رسانه بسیار انتخابی برای استفاده باشد زیرا همان‌طور که گفته شد باکتری‌ها خاص هستند. اگر ماده مغذی خاصی در محیط وجود داشته باشد، مطمئناً باکتری رشد نمی‌کند و می‌میرد. از طرف دیگر، این محیط بسیار پیچیده است. محیط پیچیده از اهمیت برخوردار است زیرا امکان رشد گسترده میکروبی را فراهم می‌کند. رشد باکتری‌ها می‌تواند تا حدود زیادی به دلیل مقادیر زیاد مواد مغذی توسط این محیط پشتیبانی شود. انتخاب اینکه از کدام محیط رشد استفاده شود بستگی به این دارد که میکروارگانیسم در حال کشت یا انتخاب باشد.

وابسته به سویه، ممکن است دیش کشت باکتری به مدت 24 تا 36 ساعت در انکوباسیون قرار گیرد تا تولید باکتری امکان‌پذیر شود. در پایان جوجه‌کشی باید باکتری‌های کافی برای تشکیل کلونی‌های قابل مشاهده در مناطق تحت تأثیر حلقه تلقیح وجود داشته باشد. از بین این کلونی‌های مخلوط، می‌توان گونه‌های باکتریایی یا قارچی منفرد را بر اساس تفاوت‌های ریخت‌شناختی (اندازه / شکل / رنگ) آن‌ها شناسایی کرد و سپس به یک دیش جدید زیر کشت داد تا یک محیط کشت خالص برای تجزیه و تحلیل بیشتر بدست آورد.

تجهیزات اتوماتیک در سطح صنعتی برای پوشش رگه‌های محیط جامد به منظور دستیابی به عقیم‌سازی و سازگاری بهتر رو کار با سرعت قابل اطمینان تر استفاده می‌شود. در حالی که به صورت دستی خط می‌خورد، از خراشیدن محیط جامد پرهیز می‌شود زیرا خطوط بعدی رگه آسیب می‌بیند و رسوب غیر یکنواخت تلقیح در مکان‌های آسیب‌دیده روی رشد متوسط ​​خوشه‌ای میکروب‌ها که ممکن است به خطوط ریز نزدیک شود، گسترش می‌یابد.

کشت باکتری خطی

محیط کشت سلولی باکتری چیست؟

برخی از میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری یا ویروس، فقط درون سلول زنده رشد می‌کنند. بنابراین برای کشت آ‌ن‌ها باید از محیط‌های کشت سلولی استفاده کرد. در برخی سلول‌ها قبل از آلوده نمودن با باکتری، کشت داده می‌شوند و سپس با استفاده از گیرنده‌های خاصی که دارند، با آلوده نمودن محیط کشت سلولی با باکتری می‌توان آن‌را تشخیص داد. اگر علاقه‌مند به آشنایی با میکروارگانیسم‌های پرکاربرد در حوزه بیوتکنولوژی، تولیدات میکروبی به وسیله میکروارگانیسم‌های نوترکیب و تولید در مقیاس صنعتی هستید می‌توانید آموزشی که در ادامه است را مطالعه کنید.

برای مشاهده فیلم آموزش بیوتکنولوژی میکروبی + اینجا کلیک کنید.

معرفی فیلم آموزش آزمایشگاه میکروبیولوژی ۱

آموزش میکروبیولوژی

میکروبیولوژی از پر اهمیت‌ترین شاخه‌های علوم زیستی، و درس پایه در بسیاری از رشته‌ها و گرایش‌های زیست‌شناسی و علوم پزشکی و دندانپزشکی است. به غیر از بیماری‌زایی، باکتری‌ها در جنبه‌های مثبتی مانند تولید آنزیم‌ها، ویتامین‌ها، پروتئین‌ها، الکل، صنعت مواد غذایی، صنعت محیط زیست و کشاورزی استفاده می‌شوند. همچنین میکروب‌ها یکی از ارگانیسم‌هایی هستند که نقش اساسی در چرخه طبیعت دارند.

میکروبیولوژی گرایش‌های مختلفی مانند میکروب‌شناسی عمومی، میکروبیولوژی پزشکی، بیوتکنولوژی میکروبی و میکروبیولوژی صنعتی دارد که هریک به مباحث خاصی می‌پردازند. در این فرادرس، تاریخ میکروبیولوژی، میکروسکوپ، ژنتیک، متابولیسم و رشد میکروارگانیسم‌ها در هشت فصل با استفاده از فیلم آموزشی، تصاویر گویا و توضیحات مفصل مورد بحث قرار گرفته‌اند. مدرس این آموزش ممدحسین عباسپور مطلق مقدم، رتبه ۲ آزمون کارشناسی ارشد، دانشجوی بیوتکنولوژی میکروبی دانشگاه تهران و دارنده مدال برنز در بیست و یکمین المپیاد علمی دانشجویی زیست‌ شناسی ارائه است.

اگر این مطلب برای شما مفید بوده است، آموزش‌ها و مطالب زیر نیز به شما پیشنهاد می‌شوند:

مریم بصیری (+)

«مریم بصیری»، فارغ التحصیل مقطع کارشناسی ارشد رشته سلولی و مولکولی، گرایش بیوشیمی و علاقه‌مند به مباحث روانشناسی و علوم اعصاب است. او در حال حاضر مطالب زیست شناسی، سلامت، پزشکی و روانشناسی مجله فرادرس را می‎نویسد.

بر اساس رای 5 نفر

آیا این مطلب برای شما مفید بود؟

نظر شما چیست؟

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *