کروماتوگرافی کاغذی چیست؟ | توضیح علمی به زبان ساده

در مطالب پیشین «مجله فرادرس» در رابطه با کروماتوگرافی از جمله کروماتوگرافی گازی و اصطلاحات مهم کروماتوگرافی گازی صحبت کردیم. همچنین با کروماتوگرافی لایه‌نازک و HPLC نیز آشنا شدیم. در این مطلب یاد می‌گیریم که کروماتوگرافی کاغذی چیست و نحوه آماده‌سازی کاغذ کروماتوگرافی را نیز مرور خواهیم کرد.

کروماتوگرافی کاغذی چیست ؟

«کروماتوگرافی کاغذی» (Paper Chromatography) از جمله روش‌های جداسازی مواد به شمار می‌آید که برای جداسازی از یک کاغذ (نوار کاغذی) به عنوان فاز ساکن بهره می‌گیرد. کروماتوگرافی کاغذی روشی ارزان‌قیمت برای جداسازی مواد شیمیایی از یکدیگر است و این جداسازی بر اساس سرعت متفاوت حرکت مواد در طول کاغذ انجام می‌گیرد. علاوه بر این، ابزار تحلیلی قدرتمندی است که از مقادیر کم مواد شیمیایی استفاده می‌کند.

فیلم آموزش کروماتوگرافی گازی Gas Chromatography در فرادرس

کلیک کنید

اساس کروماتوگرافی کاغذی چیست ؟

اصول کروماتوگرافی را می‌توان شامل اصول «کروماتوگرافی تقسیمی» (Partition Chromatography) و «کروماتوگرافی جذب سطحی» (Adsorption Chromatography) دانست چراکه مواد بین فازهای مایع تقسیم یا توزیع می‌شوند. فازهای موجود، آب موجود در حفرات کاغذ فیلتر و فاز دیگر نیز، نوعی فاز متحرک است که از کاغذ عبور می‌کند. همانند سایر روش‌های کروماتوگرافی، فاز متحرک از میان فاز ساکن عبور می‌کند و اجزای مخلوط‌ها با آن حمل می‌شوند. در ادامه، اجزای مختلف با سرعت‌های متفاوتی در طول کاغذ حرکت می‌کنند.

تهیه کروماتوگرام

کروماتوگرافی کاغذی از جمله ساده‌ترین روش‌هایی است که در آزمایشگاه شیمی از آن برای جداسازی رنگ‌ها همچون رنگ‌های سازنده جوهری خاص بهره می‌گیرند. در انتهای آزمایش، یک کروماتوگرام خواهیم داشت که در ادامه، نحوه انجام این روش را بررسی می‌کنیم.

فرض کنید که ۳ خودکار آبی با مدل‌های مختلف و یک نامه نوشته شده دارید و می‌خواهید به کمک آزمایشی متوجه شوید که این نامه، با کدامیک از این سه خودکار نوشته شده است. بر روی یک کاغذ کروماتوگرافی، خط مستقیمی با مداد رسم کنید. نمونه‌ جوهرهای خودکار را به طور جداگانه بر روی این خط قرار دهید. برای استفاده از جوهر نامه نیز باید بخشی از آن را در مقدار مناسبی از حلال، حل و آن را بر روی خط رسم شده قرار دهید. در تصویر (دیاگرام) زیر،‌ جوهر مربوط به نامه با حرف «M» و جوهر خودکارها با شماره مشخص شده است.

مقدار بسیار کمی از یک حلال را درون محفظه‌ای همچون یک بِشر می‌ریزیم و کاغذ را همانند تصویر زیر درون حلال فرو می‌بریم. در این مرحله توجه داشته باشید که حلال باید در زیر خط رسم شده قرار گیرد. راه‌های مختلفی برای قراردادن کاغذ درون حلال وجود دارد. گاهی اوقات کاغذ را به کمک یک گیره می‌بندند و آن‌را درون محفظه قرار می‌دهند. البته باید درب محفظه حتما بسته باشد تا درون بشر با بخار حلال اشباع شود چراکه این کار سبب جلوگیری از تبخیر حلال به هنگام بالا رفتن از ستون کاغذی در کروماتوگرافی کاغذی می‌شود.

حلال به آهستگی درون کاغذ به بالا حرکت می‌کند. اجزا مختلف جوهرها با سرعت‌های متفاوتی در این مسیر با حلال، همراه می‌شوند. در نتیجه، هریک در مسیر حرکت خود، لکه‌هایی به جای می‌گذارند که مکان‌ها آن‌ها با یکدیگر متفاوت است. به طور مثال، زمانی که حلال به طور کامل تا بالای ظرف حرکت کند، تصویری مشابه زیر خواهیم داشت.

با نگاهی به کروماتوگرام بالا به سادگی می‌توان دریافت که لکه‌های ایجاد شده در نامه و خودکار شماره ۲، هر دو یکسان هستند و در نتیجه، نامه با خودکار شماره ۲ نوشته شده است.

مقادیر ضریب بازداری در کروماتوگرافی کاغذی

با بررسی مثال بالا می‌دانیم که کروماتوگرافی کاغذی چیست و چگونه با ابزارهای ساده می‌توان از آن استفاده کرد. البته همیشه مخلوط‌ها مانند تصویر بالا، به خوبی از یکدیگر تفکیک نمی‌شوند. برخی از ترکیبات در یک مخلوط، تقریبا همزمان با بالا رفتن حلال، با آن بالا می‌روند و در مقابل نیز برخی ترکیبات، در نزدیکی خط رسم شده باقی می‌مانند.

فیلم آموزش شیمی تجزیه ۱ در فرادرس

کلیک کنید

اگر تمامی شرایط مانند نوع کاغذ و ترکیب دقیق حلال، ثابت بماند، فاصله طی شده ترکیب نسبت به حلال را با ضریبی به نام «ضریب بازداری» ( Retention Factor) توصیف می‌کنند که برای هر ترکیب، رابطه $$R_f$$ را می‌توان به صورت زیر تعریف کرد.

فاصله طی شده توسط حلال / فاصله طی شده توسط ترکیب = ضریب بازداری

مثال ضریب بازداری

اگر جزئی از یک ترکیب به میزان ۹/۶ سانتی‌متر از خط پایه و حلال، ۱۲ سانتی‌متر حرکت کرده باشد، مقدار ضریب بازداری برای این شرایط را محاسبه کنید.

‌$$\begin{equation}
\begin{aligned}
R_{f} &=\frac{9.6}{12.0} \\
&=0.80
\end{aligned}
\end{equation}$$

در مثال خودکارها و نامه، نیازی به محاسبه ضریب بازداری نبود چراکه با نگاه به کروماتوگرام این امکان وجود داشت که مقایسه دقیقی بین ترکیبات داشته باشیم. می‌توان این‌گونه فرض کرد که اگر دو نقطه (لکه) در کروماتوگرام نهایی داشتیم که رنگ یکسانی داشتند و طول برابری را نیز بر روی کاغذ طی کرده بودند، این دو ترکیب به احتمال زیاد با یکدیگر یکسان هستند. البته این فرض لزوما صحیح نیست زیرا امکان دارد که دو ترکیب با رنگ یکسان و مقادیر ضریب بازداری بسیار نزدیک به هم داشته باشیم. در ادامه مطلب به این موضوع نیز پردخته خواهد شد.

با توجه به اهمیت آشنایی با روش‌های شناسایی نمونه‌های شیمیایی، «فرادرس» اقدام به انتشار فیلم آموزش شناسایی و آنالیز دستگاهی پلیمرها کرده که لینک آن در ادامه آورده شده است.

• برای دیدن فیلم آموزش شناسایی و آنالیز دستگاهی پلیمرها + اینجا کلیک کنید.

اگر ترکیباتی بی رنگ در کروماتوگرافی کاغذی داشتیم باید چه کار کنیم؟

در برخی موارد می‌توان با انجام واکنش با ترکیبات بی‌رنگ، به ترکیبات با رنگ مشخص دست پیدا کرد. از نمونه‌های مناسب در این روش باید به کروماتوگرام‌هایی اشاره کرد که از مخلوط‌ اسیدهای آمینه بدست آمده‌اند. این ترکیبات در بسیاری از موارد بی‌رنگ هستند و برای شناسایی آن‌ها می‌توان از ترکیباتی مانند محلولی از «نینهیدرین» (Ninhydrin) استفاده کرد که بر روی کروماتوگرام، اسپری می‌شوند. دراثر واکنش نینهیدرین با آمینو اسیدها، ترکیباتی رنگی تولید می‌شود که به طور معمول، رنگی قهوه‌ای یا بنفش دارند.

فیلم آموزش آزمایشگاه شیمی عمومی در فرادرس

کلیک کنید

فرض کنید مخلوطی از آمینو اسید داشته باشید و بخواهید نوع اسیدهای آمینه موجود در مخلوط را مشخص کنید. برای سادگی کار فرض می‌کنیم که مخلوط ما تنها شامل پنج آمینو اسید معروف باشد. قطره‌ای کوچک از مخلوط را روی خط پایه کاغذ و قطره‌هایی از اسیدهای آمینه معروف را نیز در کنار آن قرار می‌دهیم.

در ادامه، کاغذ را در حلال و ظرفی مناسب جای می‌دهیم و صبر می‌کنیم تا آزمایش به طور کامل انجام گیرد و حلال تا انتها به طرف بالا حرکت کند. در تصویر زیر، نام مخلوط با حرف «M» و آمینو اسیدهای معروف با شماره نام‌گذاری شده‌اند. در انتهای کار، مکان جبهه حلال را با مداد علامت‌گذاری می‌کنیم و به کروماتوگرام فرصت می‌دهیم تا خشک شود.

بعد از خشک شدن کروماتوگرام، بر روی آن محلولی از نینهیدرین با فرمول شیمیایی $$C_9H_6O_4$$ اسپری می‌کنیم. در تصویر زیر، دیاگرام سمت چپ، پیش از اسپری کردن نینهیدرین را نشان می‌دهد. همانطور که در دیاگرام سمت راست مشاهده می‌کنید، بعد از استفاده از اسپری، لکه‌هایی به رنگ‌های قهوه‌ای و قرمز نمایان می‌شوند.

کروماتوگرافی کاغذی دو طرفه

از کروماتوگرافی کاغذی دو طرفه زمانی استفاده می‌شود که موادی با ضرایب بازداری بسیار نزدیک به هم داشته باشیم. برای توصیف این روش، بار دیگر از ترکیبات رنگی مثال قبل کمک می‌گیریم چراکه مشاهده روند آن ساده‌تر است.

این بار، تهیه کروماتوگرام را تنها با یک نمونه آغاز می‌کنیم. این نمونه بر روی خط پایه در پایین قرار دارد. مانند روش قبل، آن‌را در حلال قرار می‌دهیم و تا رسیدن حلال به بالای کاغذ، صبر می‌کنیم. پیش از آن‌که کاغذ خشک شود، مکان جبهه حلال را با مداد به صورت خط‌چین علامت‌گذاری می‌کنیم که در تصویر با «SF1» نشان داده شده است.

با دقت در تصویر بالا خواهید دید که لکه بزرگ در کروماتوگرام، شامل بخشی آبی‌رنگ و بخشی سبز‌رنگ است. این امر نشان می دهد که دو رنگ (ترکیب) موجود در مخلوط، دارای مقادیری یکسان از ضریب بازداری هستند. حتی ممکن بود این ترکیبات، رنگ یکسانی داشته باشند به گونه‌ای که نتوان در نگاه اول تشخیص داد که لکه ایجاد شده، حاصل دو ترکیب مختلف است.

کاری که در ادامه انجام می‌دهیم این است که صبر کنیم تا کاغذ به طور کامل خشک شود و کاغذ را ۹۰ درجه بچرخانیم و با حلالی دیگر،‌ آزمایش کروماتوگرافی کاغذی را با همان کاغذ قبلی انجام دهیم. احتمال بسیار کمی وجود دارد که دو ترکیب قبل در حلال دوم هم مقادیر یکسانی از ضریب بازداری داشته باشند و در نتیجه، لکه‌هایی متفاوت بوجود می‌آیند که در تصویر زیر نشان داده شده‌اند و مکان جبهه حلال دوم نیز با «SF2» مشخص شده است.

البته در حالت واقعی،‌ لکه اولیه را همانند تصویر بالا مشاهده نمی‌کنید بلکه این لکه اکنون به دو نقطه رنگی دیگر تبدیل شده است و تصویر اصلی، مشابه با تصویر زیر خواهد بود.

به کمک کروماتوگرافی کاغذی دوطرفه توانستیم مخلوط را به چهار نقطه مجزا تقسیم کنیم. البته نمی‌توان این ترکیبات را تنها با مقایسه مشخص کرد چراکه در نهایت بعد از یک کروماتوگرافی کاغذی ممکن است نقاط و لکه‌های مختلفی داشته باشیم و امکان مقایسه دشوار باشد. در این‌جا باید از مقادیر $$R_f$$ کمک بگیریم و این مقادیر را با مقادیر اندازه‌گیری شده در منابع مختلف مقایسه کنیم. البته شرایط انجام آزمایش نیز باید به طور دقیق با شرایط منبع یکسان باشد.

نحوه عملکرد کروماتوگرافی کاغذی

با وجود این‌که اجرای کروماتوگرافی کاغذی ساده است اما توضیح نحوه عملکرد آن در مقایسه با کروماتوگرافی TLC قدری دشوار است. توضیح عملکرد کروماتوگرافی کاغذی تا حدی به نوع حلال مورد استفاده بستگی دارد و در برخی منابع نیز از توضیح این موضوع صرف‌نظر می‌شود.

فیلم آموزش شیمی تجزیه ۲ در فرادرس

کلیک کنید

نقش ساختار اصلی کاغذ در کروماتوگرافی کاغذی

به بیان ساده، کاغذ از بافت سلولزی تشکیل شده و سلولز نیز نوعی پلیمر از قند ساده موسوم به گلوکز است. در تصویر زیر می‌توانید ساختار سلولز را مشاهده کنید.

نکته مهم در رابطه با سلولز این است که سلولز، زنجیری پلیمری است که در اطراف آن، گروه‌های $$OH$$ قرار دارند و به همین دلیل،‌ شامل سطحی همچون سیلیکاژل یا آلومینا در کروماتوگرافی لایه‌نازک است.

حلال کروماتوگرافی کاغذی

نمی‌توان به راحتی گفت که ترکیبات مختلف با نسبت‌های متفاوتی جذب سطح کاغذ می‌شوند چراکه بافت سلولزی، بخار آب فضای اطراف را جذب می‌کند و این جذب در زمان تولید کاغذ نیز وجود داشته است. بنابراین، کاغذ را می‌توان نوعی بافت سلولزی با لایه‌‌ای نازک از مولکول‌های آب دانست که با سطح کاغذ، پیوند دارند. در حقیقت، برهم‌کنش این مولکول‌های آب است که مهم‌ترین تاثیر را به هنگام انجام کروماتوگرافی کاغذی دارند.

کروماتوگرافی کاغذی با حلال ناقطبی

فرض کنید که برای تهیه یک کروماتوگرام از حلالی ناقطبی مانند هگزان استفاده کرده باشید. مولکول‌های ناقطبی مخلوط مورد استفاده، جاذبه کمی در برابر مولکول‌های آب متصل به سلولز خواهند داشت. در نتیجه، ترکیبات با مولکول‌هایی از این نوع تا بالا همراه با کاغذ حمل می‌شوند و مقادیر $$R_f$$ بالایی خواهیم داشت.

در مقابل، مولکول‌های قطبی، جاذبه زیادی در برابر موکول‌های آب خواهند داشت و این جاذبه در مواجهه با حلال‌های ناقطبی به مقدار بسیار کمی می‌رسد. بنابراین، در چنین شرایطی، مولکول‌های قطبی، بیشتر در لایه نازک آب اطراف سلولز حل می‌شوند و انحلال‌پذیری پایینی در برابر حلال ناقطبی خواهند داشت. از این‌رو، این ترکیبات با توجه به اینکه مدت‌ زمان بیشتری در فاز ساکن حضور داشته‌اند، به آهستگی و با سرعت پایینی در طول کاغذ حرکت خواهند کرد.

تمایل یک ترکیب برای تقسیم شدن بین دو حلال امتزاج‌ناپذیر (مانند آب و هگزان) را با نام «تقسیمی» (Partition) می‌شناسند. از این‌رو، کروماتوگرافی کاغذی که در آن از حلال ناقطبی استفاده شده باشد، موسوم به کروماتوگرافی تقسیمی است.

کروماتوگرافی کاغذی با استفاده از آب و سایر حلال‌های قطبی

اگر از آب به عنوان حلال در کروماتوگرافی کاغذی استفاده کرده باشید دیگر نمی‌توان این نوع کروماتوگرافی را نوعی کروماتوگرافی تقسیمی به شمار آورد. اگر آب را به عنوان فاز متحرک داشته باشیم و مولکول‌های آب نیز در فاز ساکن با سلولز پیوند داشته باشند، دیگر نمی‌توان تفاوت مشخصی بین مقدار صرف شده ترکیب در هیچیک از فازها در نظر گرفت و تمامی ترکیبات باید در هر دو ترکیب، انحلال‌پذیری یکسانی داشته باشند.

اگر آب، هم نقش فاز متحرک و هم نقش فاز ساکن داشته باشد، مکانیسم متفاوتی وجود خواهد داشت که این مکانیسم در سایر حلال‌های قطبی همچون الکل‌ها نیز صدق می‌کند. تقسیم شدن تنها بین حلال‌هایی رخ می‌دهد که با یکدیگر امتزاج‌پذیر نباشند که در حلال‌های قطبی مانند الکل‌ها،‌ آب و الکل با یکدیگر امتزاج‌پذیر هستند.

کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی پنج نوع کاتیون فلزی

تا اینجا به خوبی می‌دانیم که کروماتوگرافی کاغذی چیست و چطور می‌توان آن‌را پیاده‌سازی کرد. به همین، در ادامه متن می‌خواهیم آزمایشی را شرح دهیم تا به کمک آن، محلولی متشکل از یون‌های معلوم و مجهول فلزی را آنالیز کنیم.

فیلم آموزش شیمی عمومی ۱ و ۲ – مرور و حل مساله در فرادرس

کلیک کنید

جداسازی مخلوط‌ها و مشخص کردن اجزای آن‌ها کاری است که بسیاری از شیمیدان‌ها و دانشمندان انجام می‌دهند. شناسایی کیفی مواد موجود در نمونه اهمیت بالایی دارد. به طور مثال می‌توان نمونه‌هایی از آب‌های زیرزمینی تهیه و یون‌های سمی موجود در آن‌ها را شناسایی کرد.

کروماتوگرافی از اولین ابزارهایی است که در چنین مواردی می‌توان مورد استفاده قرار داد چراکه در این روش همانطور که می‌دانید می‌توان مخلوط‌ها را جداسازی و آن‌ها را به اجزای خالصی تبدیل کرد. در این آزمایش می‌خواهیم از اصول کروماتوگرافی کاغذی برای جداسازی چندین کاتیون فلزی استفاده کنیم.

یونهای $$\mathrm{Ag}^{+}, \mathrm{Fe}^{3+}, \mathrm{Co}^{2+}, \mathrm{Cu}^{2+}$$ و $${Hg^{2+}}$$، انحلال‌پذیری متفاوتی در فاز متحرک دارند که در این آزمایش، فازم متحرک شامل HCl با اتیل و بوتیل الکل است. در نتیجه، یون‌های فلزی با سرعت‌های متفاوتی در طول کاغذ بالا می‌روند. این انحلال‌پذیری متفاوت می‌تواند به دلیل تشکیل ترکیبات مختلف با یون کلرید و تفاوت در حل شدن این ترکیبات در حلال‌های آلی باشد.

گزارش کار آزمایشگاه در کروماتوگرافی کاغذی

اگر بخواهیم این آزمایش را برای دانشجویان یا دانش‌آموزان انجام دهیم باید کاغذ کروماتوگرفی را همانند تصویر زیر آماده کنیم. محلول‌های استاندارد شامل هریک از این یون‌ها را به کمک لوله مویین بر روی این کاغذ و در سمت راست آن نیز محلول شامل پنج یون را قرار می‌دهیم.

وقتی کاغذ را آماده کردیم باید آن‌را درون محلول «شوینده» (Eluent) قرار دهیم. بعد از ۷۵-۹۰ دقیقه برای این‌که کاغذ را به خوبی مشاهده کنیم باید سطح آن‌را به کمک محلولی آبی شامل پتاسیم یدید و پتاسیم فروسیانید $$({K4[Fe(CN)6]})$$، تَر کنید. در اثر واکنش با محلول اضافه شده، رنگ‌های مشخصی بر روی کاغذ ظاهر خواهند شد.

البته به یاد داشته باشید که می‌توان از رابطه مربوط به ضریب بازداری نیز استفاده کرد چراکه ممکن است محلول استاندارد برای مقایسه در اختیار نداشته باشیم. شکل دیگر رابطه مربوط به $$R_f$$ در زیر آورده شده است.

$$R_f = \frac{D}{F} $$

در ادامه، برای ارائه گزارش کار آزمایشگاه کروماتوگرافی کاغذی باید شیوه‌نامه انجام کروماتوگرافی را به همراه مواد و لوازم آزمایشگاهی مورد نیاز بیان کنیم.

مواد شیمیایی مورد نیاز در کروماتوگرافی کاغذی

• محلول ۰/۱ مولار از یون‌های زیر که به هریک به طور جداگانه یک لوله مویین اختصاص داده شده باشد.

$$\mathrm{AgNO}_{3}\\ \mathrm{Hg}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2}\\ \mathrm{Fe}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{3}\\ \mathrm{Co}\left(\mathrm{NO}_{3}\right)_{2}\\
{Cu(NO_3)_2}$$

• محلول شوینده مانند HCl با اتیل و بوتیل الکل
• محلول آشکارساز مانند محلو‌های آبی پتاسیم یدید و پتاسیم فروسیانید

لوازم مورد نیاز در کروماتوگرافی کاغذی

لوزام و تجهیزات مورد نیاز برای این آزمایش در زیر آورده شده‌اند.

• کاغذ تمیز کروماتوگرافی
• دستکش یکبار مصرف لاتکس. در صورت حساسیت می‌توانید از دستکش‌های نیتریل کمک بگیرید.
• بشر ۶۰۰ میلی‌لیتری
• کیسه فریزر
• انبرک

نکات ایمنی آزمایش کروماتوگرافی کاغذی

به هنگام انجام کروماتوگرافی کاغذی نباید با یون‌های فلزی موجود در محلول، محلول شوینده و محلول آشکارساز تماس داشته باشید. سایر نکات ایمنی مربوط به این آزمایش در زیر آورده شده‌اند.

• در ادامه آزمایش، پیش از لمس کروماتوگرام از دستکش یکبار مصرف استفاده کنید.
• در معرض بخارهای حاصل از محلول شوینده یا آشکارساز قرار نگیرید.
• کروماتوگرام خیس را روی میز آزمایشگاه رها نکنید بلکه آن‌را بر روی یک دستمال حوله‌ای قرار دهید.
• محلول آشکارساز را تنها در فضایی استفاده کنید که توسط مسئول آزمایشگاه مشخص شده است.
• بعد از پایان آزمایش، کروماتوگرام و دستکش یکبار مصرف را در سطل زباله مخصوص بیاندازید.
• پس از تماس با محلول‌های آزمایشگاهی، دست‌های خود را به دقت بشویید.

آماده سازی کاغذ کروماتوگرافی

هر دانشجو باید یک کاغذ صافی مانند تصویر بالا در اختیار داشته باشد. البته کاغذهای صافی به طور معمول به صورت دایره‌ای هستند که ابعاد مستطیلی بالا را می‌توان در داخل این دایره‌ها برای آن‌ها در نظر گرفت یا این‌که در کروماتوگرافی شعاعی از آن‌ها استفاده کرد که به انواع کروماتوگرافی در انتهای مطلب اشاره خواهیم کرد. نکته مهم در رابطه با کاغذ صافی این است که هیچ پارگی یا تا شدگی نداشته باشند.

به کمک یک مداد - و نه خودکار - خطی با خط‌کش از فاصله یک سانتی‌متری لبه کاغذ رسم کنید. در رسم این خط دقت کافی داشته باشید تا خطی صاف و بدون شیب رسم شود. نام دانشجو با مداد در بالای این کاغذ نوشته شود.

فیلم آموزش طیف بینی رامان در شیمی تجزیه دستگاهی (رایگان) در فرادرس

کلیک کنید

پیش از آن‌که به کمک لوله‌های مویین یا قطره‌چکان، محلول اصلی را بر روی کاغذ قرار دهید، روی کاغذ صافی دیگری کمی تمرین داشته باشید تا در نهایت، قطراتی با اندازه مناسب و یکسان روی کاغذ قرار بگیرند. قطر این قطره‌ها باید بین ۵ تا ۸ میلی‌متر باشند و قطره‌هایی بزرگتر از این قطر، به هنگام آزمایش در طول کاغذ پخش می‌شوند و تحلیل آن‌را دشوار می‌سازند.

محلول‌های ۰/۱ مولار را در لوله‌های آزمایش تهیه کنید و در درون هریک چند لوله مویین قرار دهید. از چپ به راست، نوع یون‌های هریک از محلول‌ها را در زیر نقاط (لکه‌ها) به کمک مداد بنویسید. در زمان انجام این کار دقت داشته باشید که لوله مویین با سایر محلول‌ها تماسی نداشته باشد و آلودگی ایجاد نشود و در انتهای کار نیز آن‌را در درون لوله آزمایش قرار دهید.

لوله آزمایش شامل مخلوطی از تمامی ۵ یون نیز به همراه لوله‌های مویین تهیه شود و نقطه‌ای (لکه‌ای) از این مخلوط نیز بر روی کاغذ کروماتوگرافی ایجاد شود. از آن‌جایی که این محلول، رقیق‌تر از محلول‌های تک‌یونی است، سه مرتبه قطره را بر روی کاغذ قرار دهید و در هر مرتبه باید صبر کنید که قطره قبلی خشک شود. به کمک یک لامپ حرارتی، سرعت خشک شدن را افزایش دهید.

چندین نمونه مجهول نیز با لوله‌های آزمایش و مویین تهیه کنید. نمونه‌های مجهول به طور معمول توسط مسئول آزمایشگاه مشخص می‌شوند. نمونه‌ مجهول شامل یک تا چهار کاتیون و رقیق‌تر از محلول‌های تک‌یونی خواهد بود. همچنین، نمونه مجهول را برای دو آزمایش باید ۲ تا ۴ مرتبه بر روی کاغذ قرار دهید و مشابه قبل، پس از هر مرتبه باید صبر کنید تا خشک شود. از آن‌جایی که ممکن است در طول آزمایش، خطایی ایجاد شود بهتر است نمونه مجهول را در دو نقطه مجزا بر روی خط پایه قرار دهید.

استفاده از کاغذ کروماتوگرافی

پس از آماده‌سازی کاغذ کروماتوگرافی، باید آن‌را در آزمایش بکار بگیرید که در ادامه به توضیح مراحل آن خواهیم پرداخت. به کمک چسب نواری، دو لبه کاغذ را مانند تصویر زیر به یکدیگر - با فاصله - بچسبانید تا شکلی استوانه‌ای داشته باشید. توجه کنید که دو لبه کاغذ با یکدیگر تماس نداشته باشند.

۱۵ میلی‌لیتر از محلول شوینده را آماده کنید و به دقت، بخشی از آن‌را درون بشر ۶۰۰ میلی‌لیتری بریزید به گونه‌ای که در کف ظرف پخش شود. همانطور که پیشتر گفته شد، بخارهای حاصل را تنفس نکنید و در صورت لزوم، در زیر هود آزمایشگاهی کار کنید. سطح محلول شوینده در بشر باید پایین‌تر از خط نشان (خط پایه) در کاغذ کروماتوگرافی باشد.

حال، کاغذ کروماتوگرافی استوانه‌ای را درون ظرف قرار دهید به شکلی که خط پایه در پایین قرار داشته باشد. همچنین، شکل استوانه‌ای کاغذ کمک می‌کند که با لبه‌های بشر تماس نداشته باشد. با دقت روی بشر را به کمک کیسه پلاستیکی (کیسه فریز) بپوشانید و آن‌را به مدت ۷۵ تا ۹۰ دقیقه در زیر هود قرار دهید. در این زمان، حلال شروع به بالا رفتن در کاغد می‌کند. بعد از پوشاندن بشر با کیسه، مطمئن شوید به صورت تراز قرار گرفته است و در طول زمان آزمایش،‌ آن‌را جابجا نکنید.

نتیجه آزمایش کروماتوگرافی کاغذی

بعد از مدت زمان در نظر گرفته شده برای کروماتوگرافی کاغذی نوبت به تحلیل آن می‌رسد. برای تدوین گزارش کار آزمایشگاه مربوط به کروماتوگرافی کاغذی در ادامه، شیوه‌نامه‌ای را ارائه می‌کنیم.

با پایان یافتن زمان تشکیل کاغذ یا «زمان توسعه کاغذ» (Development Period)، با استفاده از دستکش یکبارمصرف، کاغذ را از درون بشر خارج کنید و پیش از این کار اجازه دهید تا قطرات چسبیده به کاغذ در پایین، به داخل ظرف چکه کنند. کاغذ کروماتوگرافی را بر روی یک دستمال حوله‌ای قرار دهید و در همان لحظه به کمک مداد، جبهه حلال را علامت‌گذاری کنید. حلال باقی‌مانده در ظرف را به شکلی مناسب تخلیه و کاغذ را در زیر هود آزمایشگاه به کمک لامپ حرارتی خشک کنید.

بعد از خشک شدن کاغذ، نوبت به آشکارسازی لکه‌ها می‌رسد. کاغذ را بر روی دستمال حوله‌ای قرار دهید و در مدت زمان کوتاهی، کاغذ را به محلول آشکار ساز در زیر هود آغشته کنید یا این‌که با یک افشانه مناسب، محلول آشکار ساز را بر روی کاغذ بپاشید. حال، کاغذ تَر را بر روی دستمال حوله‌ای قرار دهید و به کمک یک لامپ حرارتی، کاغذ را خشک کنید.

در ابتدا، تک‌یون‌های معلوم را پیدا و محل آن‌ها را ثبت کنید. برخی از لکه‌ها ممکن است با گذشت زمان از بین بروند در نتیجه باید زمانی که هنوز کاغذ خشک نشده است، رنگ آن‌ها در محلی ثبت شوند. فاصله طی شده هر لکه را با یک خط‌کش ثبت کنید که در تصویر زیر با حرف «D» نشان داده شده است. برای فاصله، مرکز هر لکه را در نظر بگیرید و داده‌های بدست آمده را در جدولی یادداشت کنید.

فاصله خط پایه تا جبهه سیال را نیز اندازه‌گیری کنید که در تصویر زیر با حرف «F» نشان داده شده است. مقدار «F» در طول کاغذ باید تقریبا عدد ثابتی باشد. از این مقادیر برای محاسبه ضریب بازداری هر یون استفاده و مقادیر هریک را در جدول داده‌ها یادداشت کنید.

در بخشی که مخلوط قرار دارد، هر یون را پیدا و $$R_f$$ آن‌را محاسبه کنید. این مقادیر باید نزدیک به مقادیر محاسبه شده یون‌های معلوم باشند. در بخشی که یون‌های مجهول قرار دارند، مرکز هر لکه را پیدا و با اندازه‌گیری فاصله آن از خط پایه،‌ مقدار ضریب بازداری را محاسبه کنید. رنگ و مقادیر ضریب بازداری یون‌های مجهول ممکن است با بعضی از یون‌های معلوم مشابه باشند. به کمک این شباهت‌ها می‌توان نوع یون‌های مجهول را مشخص کرد.

در انتهای گزارش کار آزمایشگاه به شکل مناسبی، تصویری از کروماتوگرام خود به همراه محل‌ لکه‌ها رسم کنید و پس از یادداشت کردن فواصل و رنگ‌ها، کروماتوگرام را در سطل زباله بیاندازید. تا اینجای کار، دستکش‌ها، کروماتوگرام و محلول شوینده در سطل‌های زباله مخصوص به خود قرار دارند و دفع این زباله‌ها به شکل بهتری انجام می‌گیرد. پیش از ترک آزمایشگاه، دست‌های خود را به خوبی بشویید.

در تصویر زیر، نمونه‌ای از جدول داده‌ها برای تنظیم گزارش کار آزمایشگاه آورده شده است که می‌توانید برای گزارش کار کروماتوگرافی کاغذی از آن بهره بگیرید.

کروماتوگرافی کاغذی قندها

انجام کروماتوگرافی کاغذی قندها نیز به سادگی سایر ترکیبات صورت می‌گیرد. با این وجود، در ادامه به بررسی حلال و محلول آشکارساز مناسب برای کروماتوگرافی کاغذی قندها می‌پردازیم.

حلال‌ها

از حلال‌های زیر می‌توان در کروماتوگرافی کاغذی قندها استفاده کرد.

• محلول آب و فنول اشباع همراه با ۱ درصد آمونیاک
• محلول شامل «n-butanol»، استیک اسید و آب با نسبت ۴:۱:۵ حجمی/حجمی (نسبت‌ها از چپ به راست خوانده شوند.)
• محلول شامل ایزوپروپانول، پیریدین، آب و استیک اسید با نسبت ۸:۸:۴:۱ حجمی/حجمی

اسپری شناساگر

محلول‌هایی مورد نیاز برای اسپری کردن بر روی کروماتوگرام و شناسایی قندها در زیر آورده شده است.

• ریجنت «تولنز» (Tollens)
• ریجنت آنیلین دی‌فنیل‌آمین
• ریجنت رزورسینول

کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی

با توجه به مطالب گفته شده، می‌دانیم که کروماتوگرافی کاغذی چیست و در نتیجه، کاربردهای بسیار متنوعی را می‌توان برای این روش در نظر گرفت. به طور خلاصه می‌توان کاربردهای زیر را برای کروماتوگرافی کاغذی ذکر کرد.

• مطالعه فرآیند تخمیر
• کنترل خلوص مواد دارویی
• بررسی ترکیبات لوازم آرایشی
• بررسی آلودگی‌های موجود در خوردنی‌ها و آشامیدنی‌ها
• بررسی مخلوط واکنش در آزمایشگاه‌های بیوشیمی
• تعیین مقدار دارو در بدن انسان‌ها و حیوانات

فیلم آموزش کروماتوگرافی گازی Gas Chromatography در فرادرس

کلیک کنید

انواع کروماتوگرافی کاغذی

این روش کروماتوگرافی را می‌توان بسته به نوع حرکت سیال در انواع مختلفی تقسیم‌بندی کرد که در تصویر زیر آورده شده است.

• «کروماتوگرافی کاغذی بالارونده (صعودی)» (Ascending Paper Chromatography): در این روش، همانطور که از نام آن پیداست، حلال در جهت بالا حرکت می‌کند.
• «کروماتوگرافی کاغذی نزولی»(Descending Paper Chromatography):‌ در این روش، جهت حرکت حلال به دلیل گرانش و مویینگی به طرف پایین است و نام این روش نیز به خوبی نحوه انجام این روش را بیان می‌کند.
• «کروماتوگرافی کاغذی شعاعی» (Radial Paper Chromatography): نمونه در مرکز یک کاغذ صافی دایره‌ای قرار می‌گیرد. با خشک شدن نمونه، کاغذ را به صورت افقی درون یک «پتری دیش» (Petri Dish) حاوی حلال قرار می‌دهند.
• کروماتوگرافی کاغذی دوطرفه: این روش همانطور که در متن نیز به آن اشاره شد، برای نمونه‌هایی است که مقدار ضریب بازداری در آن‌ها بسیار نزدیک به هم باشد.

کروماتوگرافی کاغذی یک روش کیفی است یا کمی؟

کروماتوگرافی کاغذی را باید به عنوان روشی بسیار ساده در تحلیل کیفی نام برد که برای آنالیز نمونه‌های ساده‌ای همچون جوهرها و رنگ گیاهان مورد استفاده قرار می‌گیرد و این نمونه‌ها شامل پیوندهای کووالانسی هستند.

معرفی فیلم آموزش شناسایی و آنالیز دستگاهی پلیمرها

از جمله کاربردهای کروماتوگرافی، شناسایی نمونه‌های مختلف شیمیایی است و از میان این مواد می‌توان به پلیمرها اشاره کرد. به همین دلیل، فرادرس اقدام به انتشار دوره‌ای ۸ ساعته در قالب ده درس کرده است و در این دروس نحوه شناسایی و آنالیز دستگاهی پلیمرها آموزش داده می‌شود. در ادامه، به توضیح این دروس خواهیم پرداخت.

در درس اول این آموزش، تست‌های مقدماتی مانند پیرولیز و تست ویسکوزیته و دانسیته آموزش داده می‌شود. تعیین نوع و میزان درصد عناصر از طریق روش‌هایی همچون تکنیک XRF و جذب اتمی در درس دوم مورد بررسی قرار می‌گیرد. درس سوم به انواع روش‌های کروماتوگرافی از جمله کروماتوگرافی HPLC و گازی و تبادل یونی می‌پردازد.

کروماتوگرافی GPC به طور ویژه در درس چهارم بیان می‌شود و مزایا و معایب آن نیز مورد بررسی قرار می‌گیرد. انواع روش‌های اسپکتروسکوپی مانند روش طیف‌سنجی NMR در درس پنجم مرور می‌شود. تفسیر طیف‌های FTIR و شناخت انواع پیوندهای فعال در نمونه‌ پلیمری و همچنین، تعیین درصد بلورینگی پلیمرها از جمله مباحث درس ششم به شمار می‌آیند.

در درس‌های هفتم و هشتم، روش‌های مختلفی از جمله DSC و TGA برای آنالیز پلیمرها آموزش داده می‌شود. درس نهم به میکروسکوپ‌های نوری مانند میکروسکوپ‌های SEM و TEM اختصاص دارد. تست‌های مبتنی بر اشعه ایکس مانند XRD و XPS نیز در درس دهم آموزش داده می‌شوند.

فیلم آموزش شناسایی و آنالیز دستگاهی پلیمرها در فرادرس

کلیک کنید

خلاصه مراحل انجام کروماتوگرافی کاغذی

تا این مرحله به خوبی یاد گرفتیم که کروماتوگرافی کاغذی چیست و در ادامه،‌ مراحل انجام کروماتوگرافی کاغذی را به طور خلاصه بیان می‌کنیم.

• انتخاب نوع مناسب کروماتوگرافی کاغذی: انتخاب نوع کروماتوگرافی کاغذی بر اساس پیچیدگی حلال، کاغذ، مخلوط و ... تعیین می‌شود. به طور معمول از انواع شعاعی یا بالارونده (صعودی) به دلیل سادگی اجرا بهره می‌گیرند. بکارگیری روش‌های ذکر شده ساده است و کروماتوگرام در مدت زمان کوتاه‌تری بدست می‌آید.
• انتخاب کاغذ فیلتر مناسب: انتخاب کاغذ بر اساس اندازه حفرات آن و کیفیت نمونه انجام می‌گیرد.
• آماده‌سازی نمونه: آماده‌سازی نمونه شامل حل کردن آن در حلالی مناسب جهت تهیه فاز متحرک است.
• قرارگیری نمونه بر روی کاغذ:‌ نمونه‌ها در محل‌های مشخصی روی کاغذ ثبت می‌شوند.
• تشکیل کروماتوگرام: توسعه کروماتوگرام از طریق غوطه‌ور ساختن کاغذ در فاز متحرک صورت می‌گیرد. به دلیل خاصیت مویینگی در کاغذ، فاز متحرک در طول کاغذ حرکت خواهد کرد.
• خشک کردن و تشخیص ترکیب: زمانی که کروماتوگرام شکل گرفت، کاغذ را به کمک یک سشوار یا لامپ حرارتی خشک می‌کنند. همچنین از یک محلول شناساگر نیز می‌توان به صورت افشانه (اسپری) بر روی کروماتوگرام استفاده کرد تا بعد از خشک کردن آن، شناسایی ترکیبات به شکل ساده‌تری صورت بگیرد.