شیمی، مهندسی ۶۸۷۴ بازدید

در مطالب پیشین مجله فرادرس در رابطه با انواع کروماتوگرافی از جمله کروماتوگرافی گازی و HPLC صحبت کردیم. همچنین مطالبی را در رابطه با اصطلاحات کروماتوگرافی گازی بیان کردیم. در این مطلب قصد داریم با کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) آشنا شویم. کروماتوگرافی لایه نازک یکی از روش‌های کروماتوگرافی است که برای جداسازی مخلوط‌ها به کمک فاز ساکن مورد استفاده قرار می‌گیرد. این کروماتوگرافی را می‌توان در مقیاس‌های تحلیلی یا «مقدماتی» (Preparative) انجام داد.

مقیاس تحلیلی کروماتوگرافی لایه نازک بمنظور رصد پیشرفت فرآیند و مقیاس مقدماتی نیز برای خالص‌سازی مقادیر کمی از ترکیبات مورد استفاده قرار می‌گیرد. روش کروماتوگرافی لایه نازک ابزاری تحلیلی است که به دلیل سادگی، هزینه پایین، حساسیت بالا و سرعت جداسازی به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد. اساس کار TLC همانند سایر روش‌های کروماتوگرافی بر مبنای اختلاف در جذب فازهای متحرک و ساکن است و این اختلاف‌ها بر سرعت فرآیند تاثیرگذار هستند. هدف کروماتوگرافی لایه نازک بدست آوردن نقاطی (لکه) است که به خوبی از یکدیگر جدا شده باشند.

اصول کروماتوگرافی لایه نازک

همانطور که گفته شد، عملکرد کروماتوگرافی لایه نازک نیز مانند سایر روش‌های کروماتوگرافی است. اجزای فاز متحرک بر روی سطحی از یک فاز ساکن حرکت می‌کنند. این حرکت به گونه‌ای است که ترکیبات با تمایل جذب (چسبندگی) بیشتر، نسبت به ترکیبات با تمایل جذب کمتر، با سرعت پایین‌تری حرکت می‌کنند و در اثر این اتفاق، جداسازی انجام می‌‌گیرد. به هنگام اتمام فرآیند جداسازی،‌ هریک از ترکیبات مخلوط به صورت نقطه‌ای در سطوح مختلف در لایه (پلیت) کروماتوگرافی ظاهر می‌شوند تا مشخصه‌های ترکیب و طبیعت آن‌ها بررسی شوند. در تصویر زیر می‌توانید شکل کلی این روش را مشاهده کنید.

کروماتوگرافی لایه نازک

ضریب بازداری

بعد از این‌که جداسازی به طور کامل انجام گرفت، هریک از ترکیبات جداسازی شده به صورت نقطه‌هایی ظاهر می‌شوند که به طور عمودی از یکدیگر جدا شده‌اند. هر نقطه شامل یک «ضریب بازداری» (Retention Factor) خواهد بود. ضریب بازداری در کروماتوگرافی لایه نازک برابر با فاصله طی شده یک ترکیب نسبت به کل فاصله پوشش داده شده توسط حلال است.

فاصله طی شده توسط حلال / فاصله طی شده توسط نمونه = $$R_f$$

با توجه به این‌که ضریب بازداری برای هر ترکیب، عددی یکتا است، می‌توان از آن بمنظور مشخص کردن ترکیبات مختلف استفاده کرد. زمانی که دو ترکیب را تحت شرایط یکسان مقایسه می‌کنیم، ترکیبی که $$R_f$$ بزرگتری داشته باشد،‌ قطبیت کمتری دارد چراکه به فاز متحرک تمایلی ندارد. به طور مشابه نیز ترکیبات قطبی، $$R_f$$ کمتری دارند. مقادیر $$R_f$$ تحت تاثیر عوامل مختلفی هستند که از جمله آن‌ها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:

  • ضخامت لایه
  • مرطوب بودن صفحه TLC
  • دما
  • عمق فاز متحرک
  • جنس لایه (صفحه TLC)
  • مقدار نمونه
  • نوع حلال

شرح دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک

در ادامه، اجزای مختلف دستگاه کروماتوگرافی لایه نازک را بررسی می‌کنیم. به طور کلی، یک دستگاه کروماتوگرافی TLC شامل بخش‌های زیر است:

  • فاز ساکن (صفحه کروماتوگرافی)
  • فاز متحرک (حلال)
  • پیپت

با توجه به اهمیت آشنایی با آنالیز مواد در علم شیمی، «فرادرس» اقدام به انتشار فیلم آموزش شیمی تجزیه ۱ کرده که لینک آن در ادامه آورده شده است.

فاز ساکن

صفحه‌های TLC یا همان «پلیت»‌ (Chromatoplates) را می‌توان در آزمایشگاه تهیه کرد اما به طور معمول خریداری می‌شوند. سیلیکاژل و آلومینا از جمله معمول‌ترین فازهای ساکن به شمار می‌آیند. بسیاری از صفحه‌ها از ترکیبی استفاده می‌کنند که در طول موج‌های کوتاه فرابنفش از خود نور ساتع می‌‌کنند. این صفحه‌ها به طور معمول جنسی از شیشه، آلومینیوم و پلاستیک دارند. صفحه‌های شیشه‌ای به لحاظ شیمیایی خنثی هستند و مقاومت خوبی در برابر حرارت و لکه‌های واکنش‌پذیر دارند. از نقاط ضعف این صفحه‌ها باید به شکننده بودن و دشواری برش آن‌ها اشاره کرد.

صفحه‌های آلومینیومی و پلاستیکی را به راحتی می‌توان با قیچی برش داد اما صفحه‌های آلومینیومی در برابر لکه‌های اسیدی قوی یا عوامل اکسنده، مقاومت پایینی دارند و همچنین در دمای بالا کارایی ندارند. علاوه بر این، صفحات آلومینیومی و پلاستیکی به دلیل انعطاف‌پذیری خود سبب ناپیوستگی و پوسته‌پوسته شدن فاز ساکن خواهند شد. به یاد داشته باشید که هیچ‌گاه سطح رویی صفحه TLC را با انگشتان خود لمس نکنید زیرا چربی روی پوست یا آلودگی‌های روی دستکش سبب انحراف در نتایج می‌شوند. به جای این کار، آن‌ها را از لبه‌ها بگیرید یا به کمک انبرک آزمایشگاه، آن‌ها را جابجا کنید.

به هنگام انتخاب فاز ساکن باید خواص نمونه را نیز در نظر بگیرید. همانطور که در جدول زیر نشان داده شده است، از سیلیکاژل به طور ویژه می‌توان برای هیدروکربن‌ها و آمینواسیدها استفاده کرد. همچنین، باید در نظر داشته باشید که سیلیکاژل خاصیت اسیدی دارد. در نتیجه، جداسازی مناسبی برای نمونه‌های بازی صورت نمی‌گیرد. این مورد را در صفحه‌هایی از جنس آلومینا نیز شاهد هستیم.

کروماتوگرافی لایه نازک

البته توجه داشته باشید که آلومینا و سیلیکاژل با یکدیگر تفاوت دارند. آلومینا خاصیت بازی دارد و در مقایسه با سیلیکاژل، توانایی جداسازی نمونه‌های بزرگ را ندارد. علاوه بر این، آلومینا به لحاظ شیمیایی، واکنش‌پذیری بیشتری دارد و در نتیجه، نسبت به انتخاب ترکیبات مورد آزمایش باید دقت بیشتری داشته باشیم. در جدول زیر می‌توانید انواع فازهای ساکن و مکانیسم جداسازی آن‌ها را مشاهده کنید.

فازن ساکن مکانیسم جداسازی کاربرد
سیلیکاژل جذب سطحی استروئیدها، آمینواسیدها، الکل‌ها، هیدروکربن‌ها، آفلاتوکسین،‌ ویتامین‌ها و …
سیلیکاژل RP فاز معکوس اسیدهای چرب، ویتامین‌ها، استروئیدها،‌ هورمون‌ها
سلولز، خاک سیلیسی (نوعی خاک دیاتومه) تقسیمی کربوهیدرات، قند،‌ الکل، آمینواسید، کربوکسیلیک اسید، اسید چرپ
اکسید آلومینیوم جذب سطحی آمین، الکل، استروید، لیپید، آفلاتوکسین، ویتامین‌ها و …
سلولز PEI تبادل یونی نوکلئیک اسید، نوکلئوتید، پیریمیدین
سیلیکات منیزیم جذب سطحی استروئیدها، آفت‌کش‌ها، لیپیدها، آلکالوئیدها

فاز متحرک

انتخاب مناسب حلال را باید از جمله مهم‌ترین بخش‌های کروماتوگرافی لایه نازک برشمرد. البته این کار نیازمند کمی آزمون و خطا است. همانند انتخاب فاز ساکن، در انتخاب فاز متحرک نیز باید خواص شیمیایی آنالیت را در نظر بگیرید. برای شروع می‌توان از نسبت ۱ به ۱ هگزان اتیل استات استفاده کرد. تغییر این نسبت بر میزان $$R_f$$ تاثیر بسیاری دارد. مقادیر $$R_f$$ از صفر تا ۱ تغییر می‌کنند و عدد صفر نشان‌دهنده قطبیت بسیار پایین حلال است و عدد ۱، قطبیت بسیار بالا را در حلال (فاز متحرک) نشان می‌دهد.

در زمان انجام آزمایش نباید مقادیر ۰ و ۱ بدست بیاید چراکه ترکیبات مواد مورد آزمایش، قطبیت‌های متفاوتی دارند. اگر به عدد صفر رسیدید باید قطبیت حلال را افزایش دهید چراکه نمونه مورد آزمایش، حرکتی ندارد و به فاز ساکن چسبیده است. به طور مشابه، اگر به عدد ۱ رسیدید باید قطبیت حلال را کاهش دهید زیرا در این حلال، نمونه مورد نظر قابلیت جداسازی ندارد.

اگر بدانید یکی از اجزای محلوط در حلال احلال‌پذیر است و دیگری قابلیت انحلال ندارد، جداسازی خوبی خواهید داشت. این‌که با چه سرعتی این جداسازی انجام بگیرد و ترکیبات به سمت بالای صفحه حرکت کنند به دو عامل زیر وابسته است:

  • اگر ترکیب مورد نظر در حلال انحلال‌پذیر باشد، در صفحه TLC بالا خواهد رفت.
  • اگر ترکیب، به فاز ساکن تمایل داشته باشید، به آن می‌چسبد و در این حالت، حرکتی کند خواهد داشت یا بدون حرکت خواهد بود.

اسیدها، بازها و ترکیبات شدیدا قطبی به طور معمول به جای لکه (نقطه)، در حلال‌های خنثی رگه بر جای می‌گذارند. رگه‌ها کار محاسبه ضریب بازداری را دشوار و در برخی موارد با سایر لکه‌ها تداخل می‌کنند.

مخلوط های مفید در کروماتوگرافی لایه نازک

برای جداسازی ترکیبات بازی قوی، مخلوطی از ۱۰ درصد $$NH_4OH$$ در متانول تهیه و سپس مخلوط ۱ تا ۱۰ درصد در دی‌کلرومتان تهیه کنید. مخلوط‌های ۱۰ درصد متانول یا کمتر در دی‌کلرومتان را می‌توان برای جداسازی ترکیبات قطبی به کار برد.

پیپت

نمونه‌ها را به کمک پیپت‌های شیشه‌ای کوچک بر روی صفحه قرار می‌دهند. این لوله‌های مویین باید به اندازه‌ای باریک باشند تا نمونه را به صورت نقطه‌ای اضافه کنند اما این باریک بودن نباید به شکلی باشد که مانع از اضافه کردن آنالیت به مقدار کافی شود.

تهیه صفحه کروماتوگرافی

در ادامه قصد داریم نحوه آماده‌سازی کروماتوگرام یا صفحه کروماتوگرافی را شرح دهیم. این کار به طور معمول نیازمند این است که یک ظرف نیز آماده کنید. می‌توان برای این کار از یک شیشه مربا استفاده کرد یا این‌که تجهیزات مخصوص کروماتوگرافی لایه نازک را به کار برد. این ظرف باید مقادیر کافی از حلال را در خود داشته باشد به گونه‌ای که ته ظرف پر شود. علاوه بر این باید یک کاغذ صافی نیز در اختیار داشته باشیم تا اتمسفر را به کمک بخارات حلال، اشباع کنیم. در نهایت برای جلوگیری از تبخیر شدن باید از یک درب در بالای ظرف کمک بگیریم.

صفحه کروماتوگرافی را به مقدار مورد نیاز برش دهید و با استفاده از یک مداد، خط مستقیمی در فاصله یک سانتی‌متری از پایین صفحه رسم کنید. سپس به کمک پیپت TLC،‌ نقاطی از آنالیت را به مقدار کافی بر روی خط قرار دهید. برای این کار می‌توانید از یک نور UV کمک بگیرید تا نقاط به خوبی دیده شوند. اگر نقاط (لکه‌ها) قابل رویت نبودند، نمونه بیشتری را باید بر روی خط قرار دهید. اگر محلول استانداردی در اختیار داشتید برای مقایسه می‌توانید این نمونه را نیز در کنار نمونه مورد آزمایش خود قرار دهید تا تغییرات آن‌‌ها را با یکدیگر مقایسه کنید.

صفحه را تا حد امکان به صورت صاف در شیشه قرار دهید به گونه‌ای که به دیواره شیشه تکیه داده شده باشد. توجه داشته باشید به هنگام قرار دادن صفحه در ظرف، حلال نباید از خط رسم شده بالاتر باشد بلکه نیروی مویینگی باید حلال را به طرف بالا بکشد. همچنین نباید اجازه دهید که حلال تا انتهای صفحه بالا بیاید. در انتهای کار، به محض خارج کردن صفحه کروماتوگرافی، با استفاده از یک مداد، خطی در محل جبهه حلال رسم کنید. با استفاده از نور UV، دایره‌ای به کمک مداد در اطراف لکه‌های ایجاد شده بکشید.

اصول tlc

مشاهده نتایج کروماتوگرافی لایه نازک

اگر از صفحه‌های فلورسنت استفاده کرده باشید، تعدادی از ترکیبات را با تابش نور فرابنفش مشاهده خواهید کرد. قطع نور نیز لکه‌های تیره را بر روی صفحه کروماتوگرافی پدید می‌آورد. باید خطی را با استفاده از مداد در اطراف این لکه‌های تیره رسم کرد. برای ترکیباتی که در برابر نور UV فعال نیستند باید از برخی لکه‌های شیمیایی کمک گرفت که ید از معمول‌ترین آن‌ها است. صفحات را در ظرفی حاوی ید پراکنده در سیلیکاژل یا به طور کلی در ظرفی حاوی بلورهای ید به مدت یک دقیقه قرار می‌دهند.

بیشتر ترکیبات آلی به صورت موقت به رنگ قهوه‌ای تبدیل می‌شوند. پرمنگنات، سریک آمونیوم مولیبدن (CAM) و «پی-آنیسالدهید»‌ (p-anisaldehyde) از جمله مواد شیمیایی مورد استفاده هستند. برای اینکه از پرمنگنات کمک بگیریم باید صفحه را غوطه‌ور یا از اسپری استفاده کنیم و به کمک سشوار صنعتی، آن‌را حرارت دهیم. صفحه را در ۱۰-۲۰ سانتی‌متری سشوار نگه‌دارید تا آب آن تبخیر شود. در ادامه این صفحه را در ۵-۱۰ سانتی‌متری سشوار نگه‌دارید تا لکه‌های سفید، زرد یا قهوه‌ای نمایان شوند. گرم کردن بیش از اندازه صفحه، آن‌را صفحه را به طور کلی قهوه‌ای‌رنگ می‌کند.

مشکلات معمول در کروماتوگرافی لایه نازک

به طور معمول، مشکلاتی در کروماتوگرافی لایه نازک رخ می‌دهند که می‌توان از بروز آن‌ها جلوگیری کرد. این مشکلات در ادامه آورده شده‌اند.

لکه های بزرگ

لکه‌هایی که بر روی صفحه قرار می‌دهید نباید قطری بیشتر از ۱-۲ میلی‌متر داشته باشند. در نتیجه، اجزای جدا شده نمونه نیز هرگز قطری بزرگتر از نمونه اصلی نخواهند داشت. اگر لکه‌ای بسیار بزرگ داشتید ممکن است به دلیل هم‌پوشانی سایر اجزا با $$R_f$$ مشابه پدید آمده باشد.

جبهه غیریکنواخت حلال

این‌که جبهه‌ فاز متحرک به صورت غیریکنواخت باشد، از جمله مشکلات معمولی است که در کروماتوگرافی لایه نازک رخ می‌دهد و سبب می‌شود تا ضریب بازداری به طور صحیح محاسبه نشود. برخی از عوامل ایجاد کننده این اتفاق در زیر آورده شده‌اند.

  • صاف نبودن انتهای صفحه:‌ اگر صفحه را به درستی برش نزده باشید تا به صورت کج در انتهای ظرف قرار داده باشید،‌ جبهه‌ای غیریکنواخت خواهید داشت. برای برش مناسب بهتر است از یک خط‌کش کمک بگیرید.
  • کافی نبودن حلال: بسته به اندازه ظرف باید به اندازه کافی حلال داشته باشید تا به مقدار کافی به بالای ظرف منتقل شود.

بسیار کم پیش می‌آید که از آب به عنوان حلال در کروماتوگرافی لایه نازک استفاده شود چراکه به دلیل کشش سطحی، جبهه‌ای غیریکنواخت بدست می‌دهد.

رگه

اگر نمونه‌ای که بر روی لایه (صفحه) قرار می‌گیرد، غلظت بالایی داشته باشد، نمونه به جای این‌که به شکل یک نقطه به بالا حرکت کند، به شکل «رگه‌مانند» (Streak) حرکت خواهند کرد. به عبارت دیگر، حلال نمی‌تواند نمونه غلیظ را به شکل مناسبی حمل کند و در حد توان خود، نمونه را به بالا می‌برد و باقیمانده آن در محل اولیه بدون حرکت خواهد بود. برای جلوگیری از این اتفاق باید نمونه را رقیق کرد. برای این‌که مطمئن شوید به میزان کافی محلول در اختیار دارید از یک نور UV کمک بگیرید.

لکه دار شدن

نمونه باید بالاتر از سطح حلال قرار بگیرد و اگر این اتفاق صورت نگیرد،‌ نمونه پیش از آن‌که در صفحه کروماتوگرافی لایه نازک به بالا حرکت کند توسط حلال، شسته خواهد شد.

مثال کروماتوگرافی لایه نازک

از کروماتوگرافی لایه نازک برای بررسی سه نوع مسکن و کافئین تحت نور ماورابنفش استفاده کرده‌ایم. این نمونه‌ها از چپ به راست در صفحه کروماتوگرافی به ترتیب زیر قرار گرفته‌اند.

  • ایبوپروفن (ICU)
  • کافئین (CAF)
  • نوعی مسکن (ناشناخته)
  • استامینوفن (PAR)
  • آسپیرین (ASP)

در تصویر زیر، پنج نمونه را پیش از انجام «شویش» (Elution) مشاهده می‌کنید.

کروماتوگرافی لایه نازک

این نمونه‌ها در برای قرار گرفتن بر روی صفحه در اتانول حل شده بودند. صفحه در درون یک بشر قرار داده شد و اتیل اتانوات به عنوان حلال مورد استفاده قرار گرفت. در تصویر زیر، نحوه حرکت لکه‌ها را مشاهده می‌کنید. به وضوح قابل مشاهده است که دو ماده فعال در مسکن ناشناخته (u) وجود دارند.

کروماتوگرافی لایه نازک

مزایا و معایب استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک

کروماتوگرافی لایه نازک روش بسیار ارزان‌قیمت و ساده‌ای است و دانش‌آموزان و دانشجویان می‌توانند از اصول اولیه آن برای فهم دقیق کروماتوگرافی استفاده کنند. همچنین، مواد و دستگاه‌های لازم برای انجام این روش، بسیار ساده و ابتدایی هستند. در نتیجه، زمانی‌که بهترین نوع حلال مشخص شد، می‌توان از آن در سایر روش‌ها همچون HPLC بهره برد.

تا زمانی که فاز متحرک بتواند نتایج قابل قبولی ارائه کند، بیش از ۱ ترکیب را می‌توان برای جداسازی مورد استفاده قرار داد. همچنین، به راحتی می‌توان حلال را تعویض و نتایج را با یکدیگر مقایسه کرد. برای بررسی میزان خلوص مواد نیز می‌توان از کروماتوگرافی لایه نازک کمک گرفت.

در مقابل مزایای بسیار این روش، صفحات کروماتوگرافی لایه نازک برای جداسازی در طول‌های زیاد مناسب نیستند. همچنین، موارد محدودی به کمک این روش قابل شناسایی هستند. با توجه به اینکه کروماتوگرافی لایه نازک در فضای باز انجام می‌گیرند، عواملی همچون رطوبت و دما بر نتیجه نهایی تاثیرگذار خواهند بود.

اگر این مطلب برای شما مفید بوده است، آموزش‌ها و مطالب زیر نیز به شما پیشنهاد می‌شوند:

بر اساس رای ۱۰ نفر
آیا این مطلب برای شما مفید بود؟
شما قبلا رای داده‌اید!
اگر بازخوردی درباره این مطلب دارید یا پرسشی دارید که بدون پاسخ مانده است، آن را از طریق بخش نظرات مطرح کنید.

«سهیل بحرکاظمی» دانش‌آموخته کارشناسی ارشد رشته مهندسی نفت از دانشگاه علوم و تحقیقات تهران است. به عکاسی و شیمی آلی علاقه دارد و تا امروز تولید مطالب متنوعی از مجله فرادرس را در حوزه‌های شیمی، هنر و بازاریابی به عهده داشته است. او اکنون به عنوان دبیر ارشد مجله علمی-آموزشی فرادرس فعالیت می‌کند.

نظر شما چیست؟

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد.