کروماتوگرافی تبادل یونی چیست؟ — به زبان ساده

کروماتوگرافی تبادل یونی (Ion Exchange Chromatography | IEC) یکی از روش‌های پرکاربرد کروماتوگرافی در شیمی و زیست‌شناسی است که امکان جداسازی یون‌ها و مولکول‌های قطبی را با استفاده از تبادل‌گر یونی فراهم می‌کند. این روش که از دو فاز متحرک و ساکن تشکیل شده است، برای جداسازی پروتئین‌ها، نوکلئوتیدها، کربوهیدرات‌ها و آمینواسیدها به کار می‌رود. کروماتوگرافی تبادل یونی براساس بار نمونه به دو نوع کروماتوگرافی تبادل کاتیونی و آنیونی تقسیم می‌شود. روش کروماتوگرافی در انتهای مطلب به‌صورت کوتاه توضیح داده شده است. با مطالعه این مطالب با مراحل و کاربردهای کروماتوگرافی تبادل یونی آشنا می‌شوید.

کروماتوگرافی تبادل یونی چیست ؟

کروماتوگرافی تبادل یونی یا به صورت کوتاه، «کروماتوگرافی یونی» (Ion Chromatography | IC) از نوع کروماتوگرافی ستونی است که جداسازی آنالیت در آن بر اساس بار الکتریکی انجام می‌شود. در واقع جداسازی در کروماتوگرافی یونی به دو روش تبادل یون و حذف یون انجام می‌شود که روش تبادل یون، رایج‌ترین روش آن است. در تبادل یون، بر اساس جذب یون‌های ناهمنام و در حذف یون، بر اساس دفع یون‌های همنام، آنالیت جدا می‌شود. در اینجا به طور کلی به روش کروماتوگرافی تبادل یونی پرداخته شده است.

فیلم آموزش کروماتوگرافی گازی Gas Chromatography در فرادرس

کلیک کنید

این تکنیک برای جداسازی ترکیب‌های بارداری مانند پپتیدها، پروتئین‌ها و آمینواسیدها به کار می‌رود. کروماتوگرافی یونی بر اساس نوع بار آنالیت به کروماتوگرافی تبادل کاتیونی و کروماتوگرافی تبادل آنیونی تقسیم می‌شود.

• کروماتوگرافی تبادل کاتیونی: وقتی آنالیت بار مثبت داشته باشد از کروماتوگرافی تبادل کاتیونی استفاده می‌شود. در این تکنیک فاز ساکن بار منفی دارد و مولکول‌هایی با بار مثبت را جذب می‌کند.
• کروماتوگرافی تبادل آنیونی: برخلاف تبادل کاتیونی در تبادل آنیونی، وقتی آنالیت بار منفی داشته باشد، فاز ساکن بار مثبت دارد و مولکول‌هایی با بار منفی را جذب می‌کند.

کاربرد کروماتوگرافی یونی

از کروماتوگرافی تبادل یونی برای آنالیز و جداسازی ترکیبات زیادی در صنایع دارویی، زیست‌فناوری یا بیوتکنولوژی، محیط زیست، کشاورزی و سایر صنایع استفاده می‌شود.

کاربرد کروماتوگرافی یونی در شیمی

در شیمی از کروماتوگرافی یونی برای جداسازی و آنالیز یون‌های گوناگون مانند یون‌های فلزی، الیگوساکاریدها، آلدیتول‌ها و سایر ترکیبات پلی هیدروکسی، آمینوگلیکوزیدها (آنتی‌بیوتیک‌ها)، آمینواسیدها، پپتیدها، اسیدهای آلی، آمین‌ها، الکل‌ها، فنول‌ها، تیول‌ها، نوکلئوتیدها و نوکلئوزیدها و سایر مولکول‌های قطبی استفاده شده است.

کاربرد کروماتوگرافی یونی در پزشکی

از کروماتوگرافی تعویض یونی برای اندازه‌گیری هموگلوبین گلیکوزیله (HbA1c)، «پورفیرین» (Porphyrin) و خالص‌سازی آب استفاده می‌شود. رزین‌های تبادل یونی به‌طور مصنوعی برای دیالیز کلیه و همچنین جداسازی ترکیبات خون کاربرد دارند.

جداسازی پروتئین ها

از ترکیب کروماتوگرافی تبادل یونی و «کروماتوگرافی مایع پروتئینی سریع» (Fast Protein Liquid Chromatography | FPLC) برای خالص‌سازی پروتئین‌ها استفاده می‌کنند. آمینواسیدها، سازنده پروتئین‌ها، ترکیبات «یون دوقطبی» (Zwitterionic) هستند. یون دوقطبی دسته‌ای از ترکیبات شیمیایی هستند که هر دو گروه بار مثبت و منفی را دارند و بسته به pH محیط می‌توانند منفی، مثبت یا بدون بار باشند. «نقطه ایزوالکتریک» (Isoelectric Point | pI) به نقطه‌ای گفته می‌شود که ترکیبات یونی دوقطبی مانند پروتئین‌ها، بدون بار باشند. نقطه ایزوالکتریک هنگام گزینش بافر شستشو برای چنین ترکیباتی دارای اهمیت است.

• اگر pH بافر بیشتر از pI پروتئین باشد، پروتئین بار منفی دارد و از رزین تبادل آنیونی برای جداسازی استفاده می‌شود.
• اگر pH بافر کمتر از pI پروتئین باشد، پروتئین بار مثبت دارد و از رزین تبادل کاتیونی برای جداسازی استفاده می‌شود.

بسته به نوع تبادل‌گر تعیین pH بافر به صورت زیر انجام می‌شود:

• تبادل‌گر آنیونی: pH بافر ۰٫۵ تا ۱٫۵ واحد بیشتر از pI پروتئین باشد.
• تبادل‌گر کاتیونی: pH بافر ۰٫۵ تا ۱٫۵ واحد کمتر از pI پروتئین باشد.

کاربرد کروماتوگرافی یونی در داروسازی

کروماتوگرافی تبادل یونی در مراحل مختلف تولید دارو مانند توسعه و کنترل کیفیت محصول استفاده می‌شود.

• بهبود پایداری و خواص انحلال‌پذیری مولکول‌های فعال دارویی
• شناسایی سیستم‌هایی با پایداری بالاتر برای حلال‌های آلی
• تعیین میزان حل‌شدن دارو با گذشت زمان
• تشخیص و تعیین کمیت مواد غیرفعال در فرمولاسیون‌های دارویی
• آنالیز و ارزیابی ناخالصی‌ها در مواد و محصولات دارویی

فیلم آموزش مقدماتی شیمی تجزیه دستگاهی در فرادرس

کلیک کنید

تبادل یونی چیست؟

«تبادل یونی» (Ion Exchange) فرایند جابه‌جایی یون‌ها بین جامدی نامحلول با یون‌هایی با بار مشابه در محلول است که با استفاده از جامدهای پلیمری یا معدنی در دستگاه‌هایی به نام تبادل‌گر یونی انجام می‌شود. تبادل‌گرهای یونی حاوی «رزین‌های تبادل یونی» (Ion-Exchange Resin) به شکل متخلخل یا ژل، «زئولیت‌ها» (Zeolite)، مونتموریونیت» (Montmorillonite) یا خاک رس هستند.

این تبادل‌گرها می‌توانند از نوع تبادل‌گرهای کاتیونی برای تبادل یون‌های با بار مثبت یا تبادل‌گرهای آنیونی برای تبادل یون‌های با بار منفی باشند. در تبادل‌گرهای آمفوتری، همزمان تبادل کاتیون‌ها و آنیون‌ها انجام می‌شود. یون‌های مخالف (Counter Ion) موجود در تبادل‌گرها می‌تواند شامل یون‌های زیر باشد.

• پروتون $$(H^+)$$ و هیدروکسید $$(OH^-)$$
• یون‌های تک ظرفیتی $$(Na^+, K^+, Cl^-)$$
• یون‌های دو ظرفیتی $$(Ca^{2+}, Mg^{2+})$$
• یون‌های معدنی چند اتمی $$(SO_4^{2-}, PO_4^{3-})$$
• بازهای آلی، مولکول‌های حاوی آمین $$(NR_2H^+)$$
• اسیدهای آلی، مولکول‌های حاوی گروه عاملی $$(COO^-)$$
• زیست‌مولکول‌هایی که قابل یونش هستند مانند: آمینواسیدها، پپتیدها و پروتئین‌ها

از تبادل یونی به‌طور گسترده برای آلودگی‌زدایی، رسوب‌زدایی و خالص‌سازی آب استفاده می‌شود. دیگر کاربردهای تبادل یونی، جداسازی مواد یا ترکیبات شیمیایی گوناگون است. این فرایند همچنین در صنایع غذایی، هیدرومتالورژی، صنایع شیمیایی، پتروشیمی، فناوری دارویی، تولید قند و شیرین‌کننده کاربرد دارد.

اساس کار کروماتوگرافی یونی

فیلم آموزش شناسایی و آنالیز دستگاهی پلیمرها

کلیک کنید

در این روش مانند سایر انواع کروماتوگرافی با استفاده از فازهای متحرک و ساکن، عمل جداسازیِ ترکیبات انجام می‌شود. کروماتوگرافی تعویض یونی برای جداسازی ترکیبات قابل یونش یا باردار، مبتنی بر ستون طراحی شده است. فاز متحرک به شکل محلول آبیِ حاوی مخلوطی است که آنالیت باید از آن جدا شود. فاز ساکن معمولاً از ترکیبات آلی بی‌اثر ساخته می‌شود و حامل یون‌های بار مخالف است.

ماتریس‌های حاوی گروه‌های عاملی با بار مخالف، آنالیت‌ها را جذب می‌کنند. فاز متحرک محلولی از ترکیبات مختلف است و افزون بر آنالیت، ترکیبات دیگری نیز وجود دارند. بار برخی از این ترکیب‌ها مشابه با آنالیت است و برای تشکیل پیوند با گروه عاملی روی سطح ماتریس با آنالیت رقابت می‌کنند.

در کروماتوگرافی تبادل کاتیونی رقابت بین آنالیت و دیگر کاتیون‌ها را می‌توان با استفاده از رابطه زیر توضیح داد.

• آنالیت بار مثبت دارد.
• فاز ساکن بار منفی دارد.

$$S—X^-C^+ + M^+\rightleftarrows S—X^-M^++ C^+$$

• $$(M^+)$$: ماده شوینده
• $$(C^+)$$: آنالیت
• $$(X^-)$$: آنیون
• $$(S)$$: فاز ساکن یا ماتریس

در این رابطه کاتیون ماده شوینده، هنگام شویش جایگزین آنالیت متصل به آنیون فاز ساکن ستون کروماتوگرافی می‌شود.

در کروماتوگرافی تبادل آنیونی رقابت بین آنالیت و دیگر آنیون‌ها را می‌توان با استفاده از رابطه زیر توضیح داد.

• آنالیت بار منفی دارد.
• فاز ساکن بار مثبت دارد.

$$S—X^+A^- + B^- \rightleftarrows S—X^+B^-+ A^-$$

• $$(B^-)$$: ماده شوینده
• $$(A^-)$$: آنالیت
• $$(X^-)$$: کاتیون
• $$(S)$$: فاز ساکن یا ماتریس

در این رابطه آنیون ماده شوینده، هنگام شویش جایگزین آنالیت متصل به کاتیون فاز ساکن ستون کروماتوگرافی می‌شود. فرایند جذب آنالیت و سپس دفع آن‌ها توسط یون‌های شوینده در ستون تکرار می‌شود و با این تبادل یون پیوسته، جداسازی آنالیت صورت می‌گیرد.

مراحل کروماتوگرافی تبادل یونی

جداسازی آنالیت در کروماتوگرافی تبادل یونی طی مراحل زیر انجام می‌شود.

• تعادل: پیش از افزودن نمونه حاوی آنالیت، ستون کروماتوگرافی با محلول بافر شروع شسته می‌شود. روند شستشو تا پایدار شدن pH ادامه می‌یابد. با عمل شستشو، گروه‌های عاملی باردار جهت تعامل با آنالیت در دسترس قرار می‌گیرند. مولکول‌ها با توجه به چگالی بار و توزیع بار سطحی که دارند، برهمکنش گوناگونی با یون‌های ماتریس از خود نشان می‌دهند. بار سطحی آن‌ها به‌شدت تحت تأثیر pH است و گزینش pH فاز متحرک باید به صورتی انجام شود که موجب جابه‌جا شدن یون مخالف و حفظ یون گروه عاملی روی ماتریس شود.
• بارگذاری: محلول حاوی آنالیت به ستون کروماتوگرافی تزریق می‌شود. گونه‌های باردار در محلول به گروه‌های عاملی با بار مخالف در ماتریس متصل می‌شوند.

• شستشو: پس از بارگذاری نمونه در ستون، عمل شستشوی ستون برای حذف گونه‌های بدون بار در محلول بارگذاری انجام می‌شود. در این مرحله علاوه بر مولکول‌های بدون بار، گونه‌های با بار مشابه گروه‌های عاملی فاز ساکن نیز حذف می‌شوند.
• شویش: برای جدا کردن آنالیت‌های متصل به فاز ساکن از «گرادیان نمکی» (Salt Gradient) استفاده می‌شود. در غلظت‌های پایین نمک، آنالیت‌هایی که گروه‌های باردار کوچک، پیوندهای ضعیف‌تر یا چگالی بار سطحی کمتری دارند شسته می‌شوند. با افزایش قدرت یونی و در غلظت‌های بالاتر نمک، آنالیت‌هایی با چندین گروه باردار با پیوند قوی‌تر یا چگالی بار سطحی بالاتر جدا می‌شوند. در این مرحله بین آنالیت و یون‌های بافر جهت اتصال به فاز ساکن رقابتی وجود دارد که در نهایت، یون‌های بافر جایگزین آنالیت شده و آنالیت از فاز ساکن جدا می‌شود.
• بازسازی ستون: ستون برای جداسازی‌های بعد توسط بافری با قدرت یونی بالا شسته می‌شود.

اجزای دستگاه کروماتوگرافی یونی

دستگاه کروماتوگرافی یونی از اجزا مختلفی تشکیل شده است. برخی از این اجزا در زیر شرح داده شده‌اند.

فاز ساکن

فاز ساکن در کروماتوگرافی تعویض یونی، رزین حاوی گروه‌های عاملی بارداری است که با گونه‌های یونی آنالیت تعامل دارد. فاز ساکن از دو قسمت تشکیل شده است.

1. گروه‌های باردار: گروه‌های عاملی که در فرایند تبادل حضور دارند با توجه به قطبیت و چگالی خود، قدرت پیوند گونه‌ها را تعیین می‌کنند.
2. ماتریس یا رزین: ماتریس حامل گروه‌های عاملی باردار است. ماتریس‌ها، سرعت جریان و پایداری فیزیکی و شیمیایی فاز ساکن را تعیین می‌کنند. ماتریس تبادل یونی بر اساس پارامترهایی مانند بار، قدرت گروه‌های عاملی، سرعت جریان و گنجایش انتخاب می‌شود.

گروه های باردار

این گروه‌ها بار محیط تبادل یونی ماتریس کروماتوگرافی را تعیین می‌کنند و به دو دسته قوی و ضعیف تقسیم می‌شوند. دسته قوی گستره pH بیشتر و دسته ضعیف تنها در بازه خاصی یونیزه می‌شوند. تبادل‌گرهای سولفونیک اسید از نوع تبادل‌گر کاتیونی قوی است. تعداد گروه‌های عاملی بر واحد وزن رزین، ظرفیت تبادل یونی یکتبادل‌گر یونی را تعیین می‌کند.

ماتریس

ویژگی‌های ماتریس که بر وضوح کروماتوگرافی مؤثر هستند عبارتند از:

• شکل ماتریس
• اندازه و گوناگونی ذرات
• ابعاد و منافذ
• آب‌دوستی و آب‌گریزی

ذرات از نظر میزان تخلخل به سه نوع تخلل زیاد، کم و بدون تخلل تقسیم می‌شوند. تخلخل زیاد، سطح تماس بیشتری در اختیار گونه‌های باردار می‌گذارد و موجب افزایش اتصالات می‌شود. ذرات متخلخل در مقایسه با تبادل‌گرهای فیبری وضوح کمتری دارند.

برای کاهش برهم‌کنش‌های غیرضروری با گونه‌های نمونه از ماتریس‌های بی‌اثر استفاده می‌شود. پایداری فیزیکی بالای ذرات ماتریس موجب بهبود تکرارپذیری و توان عملیاتی و بهره‌وری می‌شود. فاز ثابت بسته به نوع ذرات محدودیت pH و فشار خاصی دارد. برای مثال برای ذرات سیلیس نباید pH بالاتر از ۸ استفاده شود.

ماتریس‌های تشکیل شده از «پلی‌استایرن» (Polystyrene) و «دی‌وینیل بنزن» (Divinylbenzene | DVB) رایج‌ترین ماتریس مورد استفاده برای کروماتوگرافی تبادل یونی هستند. اما به دلیل آبگریز بودن سطح آن‌ها موجب تخریب پروتئین‌ها می‌شوند. تبادل‌گرهای سلولزی که سطح آب‌دوستی دارند، ماتریس‌های مناسب‌تری برای جداسازی پروتئین‌ها هستند. از دیگر ماتریس‌های تبادل یونی آبدوست «آگارز» (Agarose) و «دکستران» (Dextran) هستند.

در زیر برخی از ماتریس‌های پرکاربرد همراه با ویژگی‌های آن‌ها فهرست شده‌اند.

• سلولز: سطح آب دوست، افزایش پایداری، ارزان
• دکستران: مواد اصلاح شده با اتصال عرضی، افزایش حجم متناسب با قدرت یونی محیط
• آگارز: ظرفیت اتصال بالا، ، افزایش حجم مستقل از قدرت یونی محیط
• پلی آکریل آمید: افزایش حجم متناسب با قدرت یونی محیط
• اکریلات-کوپلیمر: پایداری pH بالا
• پلی استایرن-دیوینیلی بنزن: سطح آبگریز، ظرفیت اتصال کم برای پروتئین‌ها
• سیلیس: ناپایدار در pH های بیشتر از ۸، سفت و سخت

مبدل های یونی

مبدل‌های یونی با توجه به نوع گونه‌های یونی و ماتریس به تبادل‌گرهای کاتیونی و آنیونی تقسیم می‌شوند.

• تبادل‌گرهای کاتیونی: گروه‌های عاملی روی ماتریس بار منفی دارند و کاتیون‌ها را جذب می‌کنند.
• تبادل‌گرهای آنیونی: گروه‌های عاملی روی ماتریس بار مثبت دارند و آنیون‌ها را جذب می‌کنند.

جدول زیر تبادل‌گرهای یونی رایج را نشان می‌دهد.

فاز متحرک

محلول‌های آبی نمک رایج‌ترین ماده شوینده در کروماتوگرافی مبادله یونی است. این محلول می‌تواند مخلوطی از چند نمک همراه با درصد کمی از حلال آلی باشد. محلول سدیم کلرید به دلیل حفظ ساختار پروتئین، پرمصرف‌ترین ماده شوینده برای جداسازی در این روش است. ماهیت و غلظت یون‌های مخالف و pH ماده شوینده از مهم‌ترین ویژگی‌های تأثیرگذار در فرایند شویش هستند. گازهای موجود در محلول می‌توانند بر غلظت گونه‌ها تأثیر بگذارند، به همین دلیل برای تهیه ماده شوینده از آب گاززدایی شده استفاده می‌کنند. کربن دی‌اکسید هوا به شکل کربنیک اسید $$(H_2CO_3)$$ در آب حل می‌شود. این اسید غلظت مؤثر شوینده حاوی سدیم هیدروکسید $$(NaOH)$$ را تغییر می‌دهد.

در فرایند جداسازی پروتئین‌ها، برای حفظ ساختار و کارکرد آن‌ها، مواد افزودنی مختلفی در فاز متحرک وجود دارند. برخی از مواد افزودنی رایج در شوینده عبارتند از:

• EDTA
• پلی ال‌ها: مانند گلیسرول، گلوکز و ساکاروز
• مواد شوینده
• اوره و «گوانیدینیم کلرید» (Guanidinium Chloride)
• لیپیدها
• حلال‌های آلی
• یون‌های دوقطبی
• شناساگر «سولفیدریل» (Sulfhydryl)
• لیگاندها
• بازدارنده‌های پروتئاز

بافر

pH از پارامترهای مهم در فرایند جداسازی با استفاده از مواد بافر کنترل می‌شود. در طول جداسازی pH فاز متحرک باید ثابت باشد زیرا تغییرات pH بر پایداری نمونه مؤثر است. مهم‌ترین عواملی که در گزینش فاز متحرک اهمیت دارند عبارتند از:

• بار بافر
• قدرت بافر
• pH بافر

در جدول زیر برخی از رایج‌ترین بافرهای مورد استفاده در کروماتوگرافی تبادل کاتیونی و آنیونی فهرست شده است.

آشکارساز

در کروماتوگرافی تعویض یونی به‌طور معمول از آشکارسازهای رسانایی‌سنجی استفاده می‌شود. همچنین آشکارسازهای فرابنفش، فلورسانس، طیف‌سنج جرمی و «پراکندگی نور چندزاویه‌ای» (Multi-Angle Light Scattering | MALS) نیز در این تکنیک به کار می‌رود. برای نتایج بهتر، هنگام استفاده از آشکارسازهای رسانایی‌سنجی، از شوینده‌های رقیق استفاده می‌شود. با استفاده از روش طیف‌نورسنجی یا اسپکتروفتومتری، می‌توان آنیون‌هایی که در ناحیه فرابنفش جذب دارند را به طور مستقیم تشخیص داد.

فیلم آموزش بیوشیمی عمومی - اسیدهای آمینه، پپتیدها و پروتئین ها (رایگان) در فرادرس

کلیک کنید

کروماتوگرافی چیست ؟

کروماتوگرافی یا به فارسی سَوانگاری که از دو واژه لاتین «chroma» به معنی رنگ و «graphein» به معنای نوشتن تشکیل شده، مجموعه‌ای از روش‌های آزمایشگاهی در شیمی تجزیه است که با هدف جداسازی یا آنالیز مخلوط‌ها توسط «میخایل تسوت» (Mikhail Tsvet) ایجاد شد. به‌طور کلی، کروماتوگرافی با روش‌های گوناگون با عبور فاز متحرک حاوی آنالیت از فاز ساکن، آنالیت را از سایر مولکول‌های موجود در مخلوط جدا می‌کند.

مهم‌ترین کاربرد این تکنیک جهت خالص‌سازی ماده‌ای خاص در مخلوطی از مواد است. دقت بالا در جداسازی از ویژگی‌ها کروماتوگرافی است که می‌توان از آن برای جدا کردن پروتئین‌هایی که تنها تفاوت آن‌ها یک آمینو اسید است استفاده کرد. کروماتوگرافی همچنین برای جداسازی مواد فرار و محلول نیز به کار می‌رود.

انواع کروماتوگرافی

روش‌های مختلفی در کروماتوگرافی وجود دارند که همه این روش‌ها اساس یکسانی دارند که عبارتند از:

نتیجه‌گیری

کروماتوگرافی مبادله یونی، دسته‌ای از کروماتوگرافی مایع است که برای جداسازی ترکیبات آلی و معدنی کاربرد دارد. این روش جداسازی بر اساس بار آنالیت به دو دسته کروماتوگرافی تبادل کاتیونی و کروماتوگرافی تبادل آنیونی تقسیم می‌شود. به طور کلی کروماتوگرافی تبادل یونی از دو فاز متحرک و ساکن تشکیل شده است.

فاز ساکن حاوی گروه‌های عاملی یونیزه شده باردار است که با یون‌های آنالیت بار مخالف تعامل دارند و در فرایند شویش، یون‌های محلول بافر شستشو جایگزین یون‌های آنالیت می‌شوند. شویش و جداسازی مولکول‌هایی که به فاز ساکن متصل هستند با تغییر شرایط زیر انجام می‌شود.

1. تغییر pH بافر
2. افزایش غلظت یون‌های مخالف

به طور گسترده از کروماتوگرافی مبادله یونی برای شناسایی و آنالیز داروها، پروتئین‌ها، پادتن‌ها و نوکلئیک اسیدها استفاده می‌شود. به دلیل گستردگی کروماتوگرافی تبادل یونی، این عبارت گاهی به‌جای «کروماتوگرافی یونی» نیز استفاده می‌شود. با این حال کروماتوگرافی یونی عنوانی کلی است که شامل کروماتوگرافی تبادل یونی (IEX)، کروماتوگرافی حذف یون (IEC) و کروماتوگرافی جفت یونی (IP) می‌شود.