کروماتوگرافی چیست؟ – به زبان ساده

مقدمه

کروماتوگرافی به ما کمک می‌کند تا واکنش‌دهنده‌ها و فرآورده‌ها را در مخلوط از یکدیگر جدا کنیم و به خوبی بتوانیم فرآورده C را مورد بررسی قرار دهیم.

کروماتوگرافی ستونی

اصول کروماتوگرافی

در ابتدا بهتر است با عباراتی که در کروماتوگرافی مورد استفاده قرار می‌گیرند آشنا شویم.

تا به اینجای مطلب به شکل کلی با مفهوم کروماتوگرافی آشنا شده‌اید. کروماتوگرافی یکی از تکنیک‌های تجزیه شیمیایی ترکیب‌های مختلف است. برای آشنایی با مفهوم و روش تجزیه شیمیایی و تکنیک‌های کروماتوگرافی، پیشنهاد می‌کنیم فیلم آموزشی و رایگان زیر را مشاهده کنید.

قبل از ادامه، بهتر است آزمایشی را انجام دهیم تا قدرت کروماتوگرافی را بهتر نشان دهد.

• در مرحله اول مقداری برگ جمع کنید و در ظرفی آن‌ها را خرد کنید.
• قطره‌ای از این عصاره برگ را در حدود نیم سانتیمتر بالاتر از لبه کاغذ،‌ روی کاغذ کروماتوگرافی بریزید. کاغذ کروماتوگرافی از سلولوز ساخته شده است و تقریبا قطبی است.
• نوار کاغذی را در شیشه‌ای حاوی استون قرار دهید. مقدار استون باید به گونه‌ای باشد که لبه پایینی کاغذ به خوبی در آن غوطه‌ور شود. بمنظور جلوگیری از تبخیر محلول، روی ظرف را با درب بپوشانید.
• به محلول فرصت دهید تا به کمک نیروی مویینگی، از داخل کاغذ به طرف بالا حرکت کند. زمانی که حلال به نقطه نهایی خود رسید، آن را از داخل شیشه خارج کنید و مشاهدات خود را یادداشت کنید. اجزای مختلف تشکیل‌دهنده رنگِ برگ از یکدیگر جدا خواهند شد. آیا می‌دانستید که رنگ یک برگ از ترکیبات متعددی تشکیل شده است؟

اصول جداسازی ترکیبات مختلف

فیلم آموزش کروماتوگرافی و کاربردها در فرادرس

کلیک کنید

در نتیجه برهم‌کنش‌های بالا، مشخص خواهد شد که هر جزء آنالیت، با چه سرعتی در ستون حرکت خواهد کرد. جذب و انحلال‌پذیری یک مولکول را می‌توان با انتخاب صحیح فاز متحرک و ساکن، تغییر داد.

انواع مختلف کروماتوگرافی

در طول این مقاله در خصوص «کروماتوگرافی فاز نرمال» (Normal-phase Chromatography) صحبت می‌کنیم. این نوع از کروماتوگرافی، حالتی است که در آن، فاز ساکن، قطبی (آبدوست) و فاز متحرک، ناقطبی (آبگریز) باشد. در مواردی برای کاربردهایی خاص، دانشمندان از «کروماتوگرافی فاز معکوس» (Reverse-phase Chromatography) استفاده می‌کنند که قطبیت فاز ساکن و متحرک، عکس حالت قبل است.

انواع مختلفی از کروماتوگرافی وجود دارد که هر کدام در نوع فاز متحرک و ساکن تفاوت دارند. البته اصل کلی در همه این روش‌ها یکسان است: تمایل اجزای مختلف آنالیت به فازهای ساکن و متحرک، سبب جدایش این اجزا می‌شوند. همانطور که بالاتر نیز به آن اشاره شد، نوع برهم‌کنش اجزا با فازهای ساکن و متحرک، بسته به نوع روش کروماتوگرافی ممکن است متفاوت باشد. در جدول زیر، روش‌های معمول در کروماتوگرافی آورده شده است:

کروماتوگرافی تقسیمی

«کروماتوگرافی تقسیمی» (Partition Chromatography) یکی از انواع روش‌های جداسازی است که در آن، اجزای مخلوط به دو فاز تقسیم می‌شوند و فازهای ساکن و متحرک، هردو در یک فاز قرار دارند و بنابراین مولکول‌ها در هر دوفاز پراکنده خواهند شد. کروماتوگرافی تقسیمی را به عنوان روش جداسازی اجزای حل‌شونده به کمک تقسیم شدن حل‌شونده بین دو فاز مایع می‌نامند. البته ما در این آموزش قصد داریم تا با مفاهیم ابتدایی کروماتوگرافی لایه نازک آشنا شویم.

کروماتوگرافی TLC

برای اینکه دوباره مروری کرده باشیم باید اشاره کنیم که «کروماتوگرافی لایه نازک» (Thin Layer Chromatography) که به TLC معروف است، بر روی یک لایه شیشه‌ای اندود شده با سیلیس انجام می‌شود. در این کروماتوگرافی فاز نرمال، سیلیس به عنوان فاز ساکن و حلال که لایه شیشه‌ای داخل آن قرار می‌گیرد، به عنوان فاز متحرک عمل می‌کند. فاز ساکن (سیلیس)، به شدت قطبی است درحالیکه حلال در مقایسه با سیلیس، قطبیت کمتری دارد.

اجزای قطبی آنالیت،‌ با قدرت به سیلیکا می‌چسبند و در نتیجه، با سرعت کمی در طول لایه شیشه‌ای به طرف بالا حرکت می‌کنند. اجزای ناقطبی یا اجزایی که کمتر قطبی هستند نیز به دلیل چسبندگی کم به سیلیس، با سرعت بیشتری به همراه حلال در طول لایه شیشه‌ای حرکت خواهند کرد. حال بهتر است دوباره نگاهی به تصویر ابتدای مقاله بیاندازیم:

همانطور که در بالا نشان داده شده است، ۳ جزء A، B و C از مخلوط، فاصله‌های متفاوتی را در طول لایه TLC طی کرده‌اند. اندازه‌گیری‌ها نشان می‌دهد که جزء C، یک سانتیمتر، جزء A دو سانتیمتر و جزء B، سه سانتیمتر در طول لایه حرکت کرده‌اند. حلال نیز ۵ سانتیمتر از نقطه شروع تا رسیدن به نقطه پایانی موسوم به «جبهه حلال»‌ (Solvent Front)، حرکت کرده است.

به عنوان یک قانون سرانگشتی می‌توان ذکر کرد که جزئی که از همه کمتر بر روی لایه TLC حرکت کرده باشد، بیشترین قطبیت را دارد، چراکه به شدت به سیلیس می‌چسبد. در مقابل، جزئی که بیشترین مسافت را در طول لایه طی کرده باشد، خاصیت ناقطبی بیشتری دارد و به علت انحلال در فاز متحرک، حرکت آن نیز بیشتر خواهد بود.

تشخیص قطبیت ماده با مشاهده لایه TLC

عامل بازداری عبارتست از فاصله طی شده توسط یک جزء مشخص تقسیم بر کل فاصله طی شده توسط حلال. هرقدر مقدار $$R_f$$ کمتر باشد،‌ ماده مورد نظر قطبی‌تر است. جدول زیر، فواصل طی شده و میزان عامل بازداری را در خصوص آزمایش بالا نشان می‌دهد. بر اساس مقادیر ذکر شده، می‌توان دریافت که جزء C بیشترین قطبیت و جزء B کمترین قطبیت را دارد.

ستون کروماتوگرافی

ستون کروماتوگرافی، ابزاری است که در کروماتوگرافی از آن استفاده می‌کنند. پنج روش کروماتوگرافی که در آن از ستون کروماتوگرافی بهره می‌گیرند عبارتند از:

• گازی
• مایع
• «تبادل یونی» (Ion Exchange)
• «اندازه طردی» (Size Exclusion)
• «کایرال» (Chiral)

ستون کروماتوگرافی با عملکرد بالا

«ستون کروماتوگرافی با عملکرد بالا» (High Performance Liquid Chromatographic Columns) که به ستون‌های HPLC معروف هستند از یک فاز متحرک مایع استفاده می‌کنند. این نوع از کروماتوگرافی را که با نام کروماتوگرافی مایع نیز می‌شناسند، از همان اصول کروماتوگرافی گازی استفاده می‌کند. سه نوع مختلف از ستون‌های مایع داریم:

فیلم آموزش الکتروشیمی کاربردی در فرادرس

کلیک کنید

• مایع-مایع: دارای فاز ساکنِ مایع هستند که به سطح ستون یا مواد پرشده جذب شده‌اند. پایداری این نوع از ستون‌ها پایین است و به همین سبب، استفاده از آن‌ها رواج ندارد. همچنین، عمل «بخش‌بندی» (Partitioning) نیز بین دو مایعِ متفاوت در فازهای ساکن و متحرک، رخ خواهد داد.
• مایع-جامد: در این ستون، فاز ساکن، جامد است و آنالیت به فاز ساکن جذب می‌شود.
• تبادل یونی: در ستون تبادل یونی، فاز ساکن را نوعی رزین تشکیل می‌دهد و همچنین عمل بخش‌بندی بین آنالیت و فاز ساکن انجام می‌شود.

به طور معمول،‌ ستون HPLC شامل یک ستون محافظ نیز هست. این ستون محافظ را جهت افزایش عمر و همچنین محافظت از ستون اصلی (تحلیلی) بکار می‌برند که می‌تواند موجب فیلتر کردن و حذف ریزگردها، آلودگی‌ها و مولکول‌های متصل به ستون اصلی شود. این ستون محافظ نیز، فاز ساکنی مشابه با ستون اصلی دارد.

• شیشه ضخیم
• پلیمری همچون «پلی‌اتر اترکتون»  (Polyetherethelketone)
• ترکیبی از شیشه و فولاد ضدزنگ
• ترکیبی از فولاد ضدزنگ و پلیمر

در ستون‌های HPLC، طول ستون تحلیلی معمولا بین ۳ تا ۲۵ سانتیمتر است و قطری در حدود ۱ تا ۵ میلیمتر و موادی که آن را پرمی‌کنند، قطری در حدود ۱ تا ۵ میکرومتر دارند. در ستون‌های مایع، زمانی که قطر مواد پرکننده ستون، کاهش یابد، بازده افزایش پیدا می‌کند.

ماده پر شده در ستون

HPLC فاز نرمال و معکوس

به منظور انجام HPLC نرمال، از یک فاز ساکن با خاصیت قطبی و یک فاز متحرک ناقطبی استفاده می‌شود. در زمان انجام HPLC فاز نرمال،‌ ابتدا ترکیباتی که بیشترین خاصیت ناقطبی را دارند شویش خواهند شد. در فاز معکوس، از یک فاز متحرک قطبی و یک فاز ساکن ناقطبی بهره می‌گیرند. روش فاز معکوس، معمول‌ترین روش در کروماتوگرفی مایع به شمار می‌آید. در این روش همچنین می‌توان از آب به عنوان فاز متحرک استفاده کرد چراکه ماده‌ای ارزان، غیرسمی و در محدوده پرتو فرابنفش، نامرئی است. در این روش، ابتدا قطبی‌ترین ترکیبات شویش خواهند شد.

ستون کروماتوگرافی تبادل یونی

ستون کروماتوگرافی اندازه طردی

این ستون، مولکول‌ها را بر اساس اندازه آن‌ها جداسازی می‌کند و وزن مولکولی در این روش دخیل نیست. از «غربال‌های مولکولی» (Molecular Sieves) به عنوان ماده پرکننده این ستون‌ها بهره می‌گیرند. غربال‌های مولکولی، حفراتی دارند که مولکول‌های کوچک وارد آن‌ها می‌شوند اما مولکول‌های بزرگ نمی‌توانند وارد شوند. این امر موجب خواهد شد که مولکول‌های بزرگتر، با سرعت بیشتری نسبت به مولکول‌های کوچکتر، از داخل ستون عبور کنند. از پلی‌ساکارید و سایر پلیمرها و همچنین سیلیس، به عنوان مواد پرکننده استفاده می‌کنند. اندازه حفرات برای این روش بین 4 تا 200 نانومتر است.

ستون‌های کایرال

بازده ستون

هرقدر یک ماده،‌ مدت زمان بیشتری در ستون کروماتوگرافی باشد، پیک‌‌های (قله‌های) حاصل از کروماتوگرافی، عریض‌تر می‌شوند. برای بهبود جدایش مواد در ستون، می‌توان طول ستون را افزایش داد. علاوه بر این، برای افزایش بازدهی ستون، دمای آن باید ثابت باشد. ارتفاع «سینی‌ها» (Plates) و عدد «سینی‌های نظری» (Theoretical Plates)، از عوامل تعیین کننده در بازده ستون به شمار می‌آیند.

بمنظور افزایش بازده ستون، باید عدد سینی‌ها افزایش و ارتفاع آن‌ها کاهش یابند. عدد سینی‌ها را می‌توان از رابطه‌های زیر محاسبه کرد که در این روابط، L، طول ستون و H، ارتفاع هر سینی است:

$$N=L/H$$

$$N = 16 \left( \frac { t _ { R } } { W } \right) ^ { 2 }$$