کروماتوگرافی مایع چیست؟ – به زبان ساده + کاربرد

کروماتوگرافی مایع تکنیکی است که برای جداسازی اجزای نمونه به اجزای سازنده‌اش استفاده می‌شود. این جداسازی برمبنای برهم‌کنش اجزای سازنده نمونه با اجزای فاز متحرک (حامل) و فاز ساکن اتفاق می‌افتد. فاز ساکن (جاذب) می‌تواند صفحه یا ستون کروماتوگرافی مایع باشد. به دلیل این‌ که گونه‌های مختلفی از فاز ساکن و متحرک وجود دارد، انواع مختلفی از کروماتوگرافی مایع وجود دارند. این روش‌ها براساس ویژگی‌های فیزیکی این فاز‌ها متغیر هستند. کروماتوگرافی ستونی جامد-مایع یکی از مهم‌ترین و پراستفاده‌ترین تکنیک‌های کروماتوگرافی مایع است. در این تکنیک، فاز مایع متحرک (حامل) بر بستر فاز ساکن جامد حرکت می‌کند. اجزای سازنده نمونه طی این فرایند از یکدیگر جدا می‌شوند. در این مطلب از مجله فرادرس به بررسی تعاریف مربوط به کروماتوگرافی مایع، روش‌های انجام آن و مثال‌هایی برای درک بهتر این تکنیک می‌پردازیم.

در ادامه این مطلب به بررسی اجزا و انواع سیستم کروماتوگرافی مایع می پردازیم و می‌آموزیم چگونه یک کروماتوگرام را تحلیل کنیم. همچنین با کاربرد‌های روش کروماتوگرافی مایع در صنایع مختلف اشنا می‌شویم و می‌آموزیم تاریخچه اختراع این روش به چه زمانی برمی‌گردد. با ما تا انتهای این مطلب همراه باشید تا با این مفاهیم به همراه مثال‌های آن‌ها به زبانی ساده و قابل فهم آشنا شوید.

کروماتوگرافی مایع چیست؟

کروماتوگرافی مایع یک روش جداسازی دستگاهی است که بر‌اساس برهم‌کنش اجزای نمونه با فاز ساکن و متحرک انجام می‌شود. این روش جداسازی در بسیاری از صنایع مانند داروسازی و محیط زیست کاربرد‌های فراوانی دارد. کروماتوگرافی مایع علاوه بر جداسازی ترکیبات، می‌تواند در خالص سازی و اندازه‌گیری‌های کمی اجزای نمونه نیز کاربرد داشته باشد. اجزای سازنده مخلوط بر‌اساس میزان برهمکنش اجزای آن با فاز ساکن (جاذب) جداسازی می‌شوند. بنابراین، اگر اجزای سازنده نمونه قطبیت‌های متفاوت داشته‌باشند و فاز مایع با قطبیت مشخص از ستون عبور داده شود، یک جزء از اجزای مخلوط زودتر از دیگری جداسازی می‌شود. معمولا ترکیبات به صورت گروهی حرکت می‌کنند‌ و به صورت گروه‌های مشخص جداسازی می‌شوند. برای مثال گروه‌های آلکان، گروه‌های آلدهید، گروه‌های کتون و ... از این گروه‌ها هستند. اگر گروه‌های جداسازی شده رنگی باشند‌، گروه مرتبط به راحتی شناسایی می‌شود. در ادامه این متن به بررسی هریک از این موارد می‌پردازیم.

کابردهای روش کروماتوگرافی مایع

همانطور که گفته شد، روش کروماتوگرافی مایع روشی خاص برای جداسازی است که نقش مهمی در شناسایی ترکیبات را در زمینه‌های مختلف علوم ایفا می‌کند. این روش جداسازی که بر‌اساس حرکت اجزای نمونه در فاز متحرک مایع بنا شده‌‌است کاربرد‌های فراوانی در تحقیقات زمینه‌ای دارد. از جمله این کاربرد‌ها می‌توان به جداسازی اجزا، اندازه‌گیری آن‌ها، بررسی ویژگی‌های آن‌ها، خالص‌سازی نمونه و جداسازی انانتیومر‌های ترکیبات کایرال اشاره کرد. لیست زیر کاربرد‌های روش کروماتوگرافی مایع را نشان می‌دهد.

• جداسازی ترکیبات
• آنالیز کیفی
• آنالیز کمی
• خالص‌سازی نمونه
• جداسازی ترکیبات کایرال

جداسازی ترکیبات

همانطور که اشاره شد، اصلی‌ترین استفاده روش کروماتوگرافی مایع، جداسازی اجزای تشکیل‌دهنده یک ترکیب است. با بر‌هم‌کنش اجزای نمونه با فاز متحرک و ساکن در این روش، اجزای مختلف ترکیب مورد بررسی (آنالیت) (Analyte) با سرعت‌های مختلف (به صورت جداگانه) شسته و خارج می‌شوند. نتیجه‌ی این جداسازی در نموداری به نام کروماتوگرام نشان داده می‌شود. این نمودار‌، زمان شسته‌شدن ترکیبات را نشان می‌دهد و به محققان کمک می‌کند اجزای مختلف ترکیب را شناسایی و اندازه‌گیری کنند.

به ماده‌ای که وارد ستون کروماتوگرافی می‌شود شوینده (Eluent) و به ماده جمع‌آوری شده نهایی محصول شویش (Eluate) گفته می‌شود.

آنالیز کیفی

کروماتوگرافی مایع مشخص می‌کند که چه ترکیباتی در نمونه وجود دارند. محققان با مقایسه زمان بازداری قله‌های مشخص شده در نمودار کروماتوگرام و نمودار ترکیبات مشخص مرجع می‌توانند آن‌ها را شناسایی کنند.

زمان بازداری مدت زمانی است که صرف می‌شود تا نمونه از ستون خارج شده و به آشکارساز برسد. تعریف هریک از این موارد در بخش اجزای سازنده سیستم کروماتوگرافی مایع آورده شده‌است.

آنالیز کمی

کروماتوگرافی مایع همچنین برای اندازه‌گیری‌های کمی نیز مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش میزان غلظت ترکیبات را در محلول مشخص می‌کند. با مقایسه سطح زیر نمودار نمونه و استاندارد‌های کالیبراسیون‌، می‌توان تخمین زد که مقدار هر ترکیب در نمونه چقدر است.

خالص‌سازی نمونه

کروماتوگرافی مایع یکی از روش‌هایی است که برای خالص‌سازی مواد بسیار استفاده می‌شود. در کروماتوگرافی مایعی که از قبل آماده شده و مقادیر ترکیبات آن مشخص است، می‌توان بیشتر قسمت‌های مخلوط را جدا کرد و ترکیباتی از محلول که مورد نیاز محققان است را با برنامه‌ریزی صحیح این روش، خالص‌سازی کرد.

جداسازی ترکیبات کایرال

این روش برای جداسازی تصاویر آینه‌ای مولکول‌ها (انانتیومر‌ها) بسیار کاربرد دارد. جداسازی ترکیبات کایرال یکی از مسائل مهم در مباحث داروسازی است. بدین صورت که تنها یک انانتیومر از بعضی از ترکیبات مسئولیت درمانی را دارد و ترکیب دیگر ممکن است عوارض جانبی ناخواسته به همراه داشته باشد.

یادگیری شیمی دانشگاهی با فرادرس

تکنیک‌های کروماتوگرافی از جمله کروماتوگرافی مایع از مهم‌ترین روش‌های جداسازی و تشخیص و خالص‌سازی مواد هستند که در بسیاری از صنعت‌ها از آن‌ها استفاده می‌شود. این مفاهیم از مباحثی هستند که در شیمی دانشگاهی و در مباحث شیمی تجزیه دستگاهی به آن‌ها پرداخته می‌شود. برای شناخت و یادگیری انواع روش‌های جداسازی و کروماتوگرافی و سایر مباحث پیشرفته شیمی دانشگاهی پیشنهاد می‌کنیم از فیلم‌های آموزشی حوزه شیمی دانشگاهی فرادرس بهره ببرید که با زبانی ساده ولی کاربردی این مطالب را توضیح می‌دهند. در فهرست زیر به چند نمونه از این آموزش‌ها اشاره کرده‌ایم.

همچنین با مراجعه به صفحه‌های زیر می‌توانید به آموزش‌های بیشتری دسترسی داشته باشید.

• فیلم آموزش کاربرد طیف سنجی در شیمی آلی به همراه مرور و حل تست کنکور ارشد
• فیلم آموزش کاربرد طیف سنجی در شیمی آلی
• فیلم آموزش شیمی تجزیه ۱ به همراه نکات کاربردی
• فیلم آموزش شیمی تجزیه ۲ به همراه نکات کاربردی

کروماتوگرافی ستونی چیست؟

تا اینجا به کاربرد‌های کروماتوگرافی مایع پرداختیم. حال میخواهیم درباره مفهوم کروماتوگرافی ستونی صحبت کنیم که اساس کار کروماتوگرافی مایع است. فاز جامد در کروماتوگرافی مایع معمولا یک پودر جامد خالص با خواص جذب‌کنندگی است. منظور از این مورد، جامدی است که بتواند در لایه‌های بیرونی خود اجزای گازی یا مایع دیگری را به دام بیندازد.

ستونی که در کروماتوگرافی مایع استفاده می‌شود معمولا ستونی شیشه‌ای شبیه به پیپت پاستور است. (پیپت‌هایی که در کروماتوگرافی ستونی مقیاس کوچک استفاده می‌شوند.)

خروجی باریک ستون کروماتوگرافی معمولا با فیلتری همچون پشم شیشه یا یک صفحه متخلخل سرامیکی بسته می‌شود تا از خروج مایعات از آن جلوگیری شود. سپس جامد جذب‌کننده که معمولا سیلیکا است به خوبی در ستون منسجم می‌شود تا فرایند جداسازی در بستر آن انجام شود. گاهی وقت‌ها این ستون‌ها با لایه‌ای از استیل ضدزنگ پوشانده می‌شوند.

این جای‌گیری ذرات جامد باید به گونه‌ای باشد که مولکول‌های هوا بین ذرات فاز ساکن گیر نیافتند. زیرا این پدیده باعث به‌وجود آمدن خطا در نتایج آزمایش کروماتوگرافی خواهد‌شد. سپس فاز متحرک مایع از این بستر عبور داده می‌شود و در اصطلاح گفته می‌شود که فاز ساکن مرطوب یا خیس می‌شود. در نهایت ستون برای جاگذاری در دستگاه کروماتوگرافی و انجام تزریق نمونه آماده است.

فرایند جداسازی به وسیله کروماتوگرافی هنگامی به‌درستی انجام می‌گیرد که اجزای تشکیل‌دهنده مخلوط مورد آزمایش بر‌اساس میزان برهمکنش و تمایلشان به برقراری پیوند با سطح فاز متحرک و ساکن جدا شوند. برای مثال جزیی از ماده که بیشتر به فاز ساکن تمایل دارد با سرعت کمتری حرکت می‌کند و آن جزء که بیشتر به فاز متحرک تمایل دارد با سرعت بیشتری در طول ستون حرکت خواهد کرد. همچنین بهتر انجام شدن این جداسازی به میزان قطبیت اجزای سازنده نمونه و فاز متحرک نیز بستگی دارد.

اجزای سازنده سیستم کروماتوگرافی مایع

علاوه بر ستون اشاره شده در مبحث قبل، اجزای دستگاه کروماتوگرافی مایع از چند قسمت کلیدی تشکیل شده‌است که در ادامه توضیح داده می‌شود. لیست زیر اجزای سازنده سیستم کروماتوگرافی مایع را نشان می‌دهد.

• فاز متحرک
• فاز ساکن
• ستون
• تزریق کننده (Injector)
• پمپ
• آشکارساز (Detector)
• سیستم تحلیل داده (کامپیوتر)

فاز متحرک

فاز متحرک حلالی مایع است که نمونه‌ی مورد آزمایش در آن حل شده‌است. این فاز نمونه را به سیستم کروماتوگرافی حمل می‌کند و اجازه می‌دهد اجزای نمونه با اجزای فاز ساکن واکنش دهند.

انتخاب فاز متحرک

انتخاب فاز متحرک مناسب نیز یکی از عوامل مهم است که به جداسازی صحیح اجزای نمونه در کروماتوگرافی مایع کمک می‌کند. این فاز با توجه به قطبیت فاز ساکن و نمونه مورد آزمایش انتخاب می‌شود. در زمان استفاده از فاز ساکن با قطبیت قوی مانند آلومینا‌$$Al_2O_3$$، استفاده از فاز متحرک قطبی باعث می‌شود که فاز متحرک توسط فاز ساکن جذب شود. این اتفاق می‌تواند باعث شود مولکول‌های نمونه به خوبی جداسازی نشوند . پس بهتر است با توجه به قطبیت فاز ساکن، فاز متحرکی با قطبیت متفاوت انتخاب شود. همچنین ممکن است حلال‌های انتخاب شده به عنوان فاز متحرک در طول انجام جداسازی تغییر کنند. این عمل بسته به نوع نمونه و در صورت نیاز به تغییر میزان قطبیت حلال ممکن است اعمال شود. این تغییر شبیه به جداسازی گرادیانی در کروماتوگرافی کارایی بالا HPLC است.

فاز ساکن

فاز ساکن از موادی خاص تشکیل شده‌است که درون ستون کروماتوگرافی به یکدیگر فشرده شده‌اند. این فاز می‌تواند مایع یا جامد باشد. اجزای تشکیل‌دهنده فاز ساکن حرکت نمی‌کنند و فاز متحرک از درون آن عبور داده می‌شود. فاز ساکن با اجزای تشکیل‌دهنده نمونه مورد آزمایش به شکل متفاوتی واکنش می‌دهد و این اجزا را از یکدیگر جدا می‌کند.

در تصویر زیر یک ستون کروماتوگرافی را مشاهده می‌کنید که در آن فاز متحرک قطبی (Polar mobile phase) و فاز جامد غیر قطبی (Non polar stationary phase) است. مشاهده می‌کنید که چگونه ترکیبات غیرقطبی با فاز ساکن درگیر می‌شوند و مولکول‌های قطبی به همراه فاز متحرک با سرعت بیشتری عبور می‌کنند.

انتخاب فاز ساکن

نوع ماده جذب کننده‌ای که در فاز ساکن فرایند کروماتوگرافی مایع استفاده می‌شود، یکی از مهم‌ترین عوامل برای جداسازی اجزای ترکیب است. ممکن است حتی از ترکیب چند نوع جامد مختلف نیز استفاده شود. انتخاب نوع این مواد جاذب به چند عامل مختلف مانند اندازه ذرات، میزان واکنش‌پذیری و ... بستگی دارد. میزان واکنش‌پذیری این مواد با پارامتری به نام مرتبه واکنش‌پذیری اندازه‌گیری می‌شود که تمایل ذرات ماده جاذب به انحلال در ذرات ماده نمونه است.

موادی که بالاترین مرتبه واکنش‌پذیری را دارند آن‌هایی هستند که خشک (بدون آب، آنهیدروس) هستند. سیلیکاژل و آلومینا از پراستفاده‌ترین مواد جاذب در این مورد هستند.

آلومینا به خوبی به نمونه‌هایی که به شرایط خاصی جهت جدا شدن نیاز دارند کمک می‌کند. هرچند استفاده از فاز‌های ساکن غیرخنثی باید با احتیاط بسیاری انجام بگیرد. اندک تغییری در اسیدیته آلومینا می‌تواند باعث انجام واکنشی شیمیایی بین اجزای فاز ساکن و نمونه‌ شود. اما سیلیکاژل، کمتر از آلومینا فعال است و برای بسیاری از ترکیبات مورد استفاده قرار می‌گیرد.

سیلیکا نیز به دلایلی مانند ظرفیت زیاد برای پذیرفتن نمونه، به یکی از پر استفاده‌ترین فاز‌های ساکن تبدیل شده‌است.

ستون

ستون کروماتوگرافی لوله‌ای باریک و بلند است که جداسازی درون آن انجام می‌گیرد. ستون شامل فاز ساکن است که فاز متحرک از آن عبور داده‌ می‌شود.

تزریق کننده (Injector)

اینجکتور یا تزریق کننده قسمتی است که نمونه را به درون سیستم کروماتوگرافی وارد می‌کند. اینجکتور به شکلی دقیق نمونه را قبل از این‌که وارد ستون شود به فاز متحرک تزریق می‌کند.

پمپ

پمپ کروماتوگرافی یکی از مهم‌ترین اجزای سازنده این سیستم‌هاست که سرعت فاز متحرک را در سیستم کنترل می‌کند.

آشکارساز (Detector)

آشکارساز کروماتوگرافی پسماند خروجی از ستون را بررسی و مشخص می‌کند که ترکیبات جداشده چه ترکییباتی هستند. بسته به نوع آشکارساز، می‌توان اطلاعاتی از قبیل جرم، میزان جذب یا خاصیت فلئورسانی را به دست آورد.

سیستم تحلیل داده (کامپیوتر)

سیستم تحلیل داده، اطلاعات به دست آمده از آشکارساز را را جمع آوری و پردازش می‌کند. سپس منحنی‌های کروماتوگرام را که فرایند جداسازی اجزای نمونه را نشان می‌دهد ارائه می‌کند. معمولا سیستم تحلیل داده‌ی هر دستگاه کروماتوگرافی همراه با دستگاه توسط شرکت‌های سازنده آن ارائه می‌شود.

روند انجام جداسازی در کروماتوگرافی مایع

همانطور که اشاره شد، اصلی‌ترین کاربرد سیستم‌های کروماتوگرافی، جداسازی اجزای ترکیب است. در ادامه روند انجام این جداسازی را توضیح می‌دهیم. در سیستم کروماتوگرافی مایع هر ترکیب بر‌اساس سرعت عبور از ستون جداسازی می‌شود. همانطور که اشاره شد دو فاز متفاوت در کروماتوگرافی مایع وجود دارد. فاز متحرک مایعی است که نمونه را در خود حل می‌کند و از بستر فاز ساکن عبور می‌دهد.

در ستون کروماتوگرافی هرچه میزان میل ترکیب شدن باز فاز ساکن بیشتر باشد، آن ترکیب آهسته‌تر از ستون حرکت می‌کند و بالعکس هرچه میل ترکیبی با فاز متحرک بیشتر باشد آن ترکیب سریع‌تر همراه فاز متحرک ستون را طی می‌کند.

شکل زیر مثالی از شیوه انجام این جداسازی است. محلول زردرنگ میل ترکیب شدن بیشتری با فاز متحرک دارد و با سرعت بیشتری شسته می‌شود. محلول صورتی‌رنگ میل ترکیبی بیشتری با فاز ساکن داشته و با سرعت کمتری جداسازی می‌شود.

چگونه کروماتوگرام را تحلیل کنیم

در بخش اجزای سازنده سیستم کروماتوگرافی گفته شد که هر سیستم یک آشکارساز دارد که مواد خروجی از ستون را بررسی و مشخص می‌کند. کلمه کروماتوگرام به معنی نموداری است که توسط آشکارساز فرایند کروماتوگرافی به دست می‌آید. شکل زیر یک نمونه از نمودار کروماتوگرام را نشان می‌دهد.

نمودار کروماتوگرام یک نمودار دو بعدی است که خط عمودی آن شدت سیگنال دریافتی از کروماتوگرام را نشان می‌دهد و خط افقی آن زمان انجام جداسازی است. زمانی که هنوز هیچ ترکیبی از ستون شسته نشده‌است، خطی موازی خط افقی زمان رسم می‌شود. این خط، خط پایه نام دارد. آشکارساز بر پایه غلظت نمونه شسته شده پاسخ می‌دهد. هنگامی‌ که نمونه به آشکارساز می‌رسد یک نمودار به شکل زنگ در کروماتوگرام رسم می‌شود که ارتفاع آن، فاصله عمودی آن تا خط پایه است و سطح آن نسبت به خط پایه با رنگ آبی مشخص شده‌است.

زمان بازداری زمانی است که از تزریق نمونه تا بدست امدن پیک آن طول می‌کشد. زمان مورد نیاز برای موادی که هیچ برهم‌کنشی با فاز ساکن ندارند زمان مرده نامیده می‌شود.

اصول کار با کروماتوگرافی مایع

پس از آشنایی با اجزای سیستم کروماتوگرافی و روند انجام کار آن باید اصول انجام کار جداسازی را بیاموزیم. اصول کار با سیستم کروماتوگرافی مایع متکی بر انتخاب درست و دقیق فاز متحرک، فاز ساکن، و ستون است. روند کار با این سیستم‌ها از چند مرحله کلیدی تشکیل شده که در ادامه به آن می‌پردازیم.

• معرفی نمونه: نمونه‌ی مورد آزمایش در فاز متحرک حل و به سیستم تزریق می‌شود.
• جریان فاز متحرک: فاز متحرک که نمونه را با خود حمل می‌کند، از درون ستون که از فاز ساکن پر شده‌است عبور می‌کند. فاز ساکن بسته به نوع جداسازی مورد نیاز انتخاب می‌شود.
• برهم‌کنش با فاز ساکن: با عبور فاز متحرک از ستون کروماتوگرافی اجزای فاز متحرک و نمونه بسته به ویژگی‌های شیمی فیزیکی‌ آن‌ها به روش‌های متفاوتی با فاز ساکن برهم‌کنش دارند. این برهم‌کنش‌ها شامل جذب، تقسیم کردن و تبادل یون است.
• جداسازی اجزا: برهم‌کنش‌های مختلف بین نمونه و فاز ساکن باعث می‌شود که اجزا با سرعت‌های متفاوتی در ستون حرکت کنند. در نتیجه این اجزا از یکدیگر جدا می‌شوند. اجزایی که با فاز ساکن بیشتر درگیر می‌شوند دیرتر، و اجزایی که کمتر درگیر می‌شوند زودتر از ستون خارج می‌شوند.
• شناسایی و آنالیز: به‌محض خارج شدن یک ترکیب از ستون کروماتوگرافی، آن ترکیب توسط آشکارساز شناسایی می‌شود. آشکارساز‌ها می‌توانند از نوع فرابنفش مرئی (UV-VIS)، فلئورسنس، یا جرمی باشند. آشکارساز سیگنال‌ها را برای شناسایی به کامپیوتر جهت پردازش می‌فرستد.
• کمی‌سازی و شناسایی: پس از ارسال سیگنال‌ها به قسمت داده‌ها، کروماتوگرام‌ها رسم می‌شوند و محققان می‌توانند به اطلاعات مختلف کیفی و کمی در مورد ترکیبات نمونه دست پیدا کنند.

انواع کروماتوگرافی

امروزه در آزمایشگاه‌ها، محققان روش‌های مختلفی از کروماتوگرافی مایع را بسته به نوع نمونه مورد آزمایش به کار می‌برند. شناسایی این روش‌های مختلف می‌تواند کمک شایانی در بهینه‌سازی روش‌ جداسازی برای محققان داشته باشد. در ادامه این مطلب از مجله فرادرس به برسی انواع این روش ‌ها می‌پردازیم. لیست زیر انواع روش‌های کروماتوگرافی را مشخص می‌کند.

• کروماتوگرافی فاز نرمال
• کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC)
• کروماتوگرافی سریع
• کروماتوگرافی مایع سریع پروتئین

کروماتوگرافی فاز نرمال

کروماتوگرافی فاز نرمال اصول کلاسیک کروماتوگرافی مایع را دنبال می‌کند. در این روش کروماتوگرافی اجزای سازنده نمونه در سرعت‌های مختلف شسته می‌شوند. این فرایند بسته به نوع قطبیت هر جزء انجام‌ می‌شود. اگر فاز ساکن ستون کروماتوگرافی از فاز متحرک آن قطبی‌تر باشد به آن کروماتوگرافی فاز نرمال گفته می‌شود. به دلیل قطبی‌تر بودن فاز ساکن در این روش، جزء‌هایی از نمونه که قطبی‌تر هستند بیشتر با فاز ساکن درگیر می‌شوند و اجزایی که کمتر قطبی هستند زودتر همراه فاز متحرک حرکت می‌کنند و از ستون پایین می‌روند. این روش جداسازی در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیز استفاده می‌شود. کروماتوگرافی مایع عملکرد بالا می‌تواند در شرایط کروماتوگرافی مایع مایع که هردوفاز متحرک و ساکن مایع هستند نیز استفاده شود.

کاربرد کروماتوگرافی فاز نرمال

کروماتوگرافی فاز نرمال برای جداسازی بسیاری از ترکیبات کاربرد دارد. از جمله به ترکیبات حساس به آب، ایزومر‌های هندسی، ایزومر‌های سیس-ترانس و ترکیبات کایرال می‌توان اشاره کرد. قابلیت این روش برای جداسازی ترکیبات پچیده‌ای که قطبیت‌های متفاوت دارند، آن‌را به روشی کارآمد در زمینه‌های مختلفی مانند تحقیقات دارویی، آنالیز ترکیبات طبیعی و پایش محیط زیستی تبدیل کرده‌است.

کروماتوگرافی فاز معکوس (RPC)

در کروماتوگرافی فاز معکوس‌، قطبیت فاز متحرک و ساکن عکس آن چیزیست که در کروماتوگرافی فاز نرمال بود. به‌جای استفاده از فاز ساکن قطبی، فاز متحرک قطبی و فاز ساکن غیرقطبی استفاده می‌شود. اگر شسته شدن عاملی از نمونه نیاز به استفاده از حلال قطبی دارد، باید ابتدا از قطبی‌ترین حلال استفاده می‌شود و حلالی که کمترین قطبیت را دارد در انتها استفاده شود. فازهای متحرک قطبی که بیشتر استفاده می‌شوند حلال‌هایی قطبی مانند استون، آب، متانول و استونیتریل هستند. تهیه ستونی با فاز ساکن غیر قطبی جامد معمولا پرهزینه و سخت است زیرا بیشتر جامدهای جاذب قطبی هستند. فاز ساکن غیر قطبی می‌تواند با استفاده از پوشاندن ذرات سیلیکاژل با یک ماده غیرقطبی انجام بگیرد.

این کار باعث می‌شود تمایل سیلیکاژل به جذب مولکول‌های قطبی کاهش بیابد. روش متفاوتی در کروماتوگرافی مایع عملکرد بالا استفاده می‌شود که در آن فاز مایعی به عنوان فاز ساکن استفاده می‌شود. مایعی که کمتر قطبی است به صورت شیمیایی با سیلیکاژل قطبی پیوند برقرار می‌کند. در نتیجه در کروماتوگرافی فاز معکوس‌، ترکیباتی در نمونه که بیشترین قطبیت را دارند همراه ترکیباتی از فاز متحرک که قطبیت کمی دارند زودتر شسته می‌شوند.

کروماتوگرافی فاز معکوس کاربرد‌های بسیاری در صنایع دارویی، غذایی، نوشیدنی، محیط زیست و پزشکی قانونی دارد. فاز متحرک این روش کروماتوگرافی معمولا ترکیبی از آب یا بافر‌های آبی با حلال‌های آلی مانند استونیتریل یا متانول است.

کروماتوگرافی سریع

کروماتوگرافی سریع (Flash chromatography) روشی است که برای خالص‌سازی‌ها و جداسازی‌های مختلف در مقیاس آماده‌سازی بسیار استفاده می‌شود.

این روش نوآورانه، خالص‌سازی را به صورت خودران انجام داده و از درگیری نیروی انسانی در طول پروسه خالص‌سازی می‌کاهد.

در کروماتوگرافی نرمال و معکوس زمان بسیار زیادی صرف جداسازی ترکیبات با این روش‌ها می‌شود به این دلیل که سرعت شسته شدن ترکیبات نمونه به جاذبه زمین وابسته است،. کروماتوگرافی سریع روشی است که در آن فرایند جداسازی با استفاده از فشار هوای وارد شده یا استفاده از پمپ خلا با سرعت بیشتری انجام می‌گیرد. یک پمپ خلاء معمولا به انتهای ستون کروماتوگرافی در این روش متصل می‌شود. این عمل باعث می‌شود فاز متحرک در طول ستون کشیده شود و حرکت کند و جداسازی با سرعت بیشتری انجام بگیرد.

در مواقعی که برای سرعت بخشیدن به جداسازی از فشار هوا استفاده می‌شود، یک پمپ هوا از بالای ستون به فاز متحرک فشار وارد می‌کند تا با سرعت بیشتری حرکت کند. به همین علت است که به این نوع کروماتوگرافی، کروماتوگرافی فشار متوسط نیز گفته می‌شود. برای ایجاد فشار بر روی ستون کروماتوگرافی از گازی استفاده می‌شود که با هیچ یک از اجزای فاز متحرک و ساکن و نمونه واکنش ندهد. معمولا از گاز نیترروژن برای این کار استفاده می‌شود. معمولا تهیه تجهیزات مورد نیاز این فرایند بسیار هزینه‌بر هستند. از روش استفاده از فشار برای سرعت بخشیدن به جداسازی در کروماتوگرافی عملکرد بالا نیز استفاده می‌شود.

کابرد کروماتوگرافی سریع

در روش کروماتوگرافی سریع فشار پایین استفاده می‌شود به همین دلیل به آن کروماتوگرافی مایع فشار پایین (low pressure liquid chromatography) نیز گفته می‌شود (LPLC). با اتوماتیک کردن سیستم کروماتوگرافی‌، زمان زیادی برای محققان صرفه‌جویی می‌شود.

قابلیت این روش برای تولید کردن موادی با خلوص بالا در مدت زمان کم باعث شده به روشی کارآمد در صنایع دارویی، ایزوله کردن ترکیبات طبیعی و سنتز ترکیبات آلی بدل شود.

فشار استفاده شده در سیستم‌های کروماتوگرافی سریع چیزی حدود 1000 پاسکال ست. این درحالی است که فشار استفاده شده در روش کروماتوگرافی عملکرد بالا HPLC خیلی بالاتر است. استفاده کردن از فشار پایین تر به محققان اجازه می‌دهد اختیار عمل بیشتری در تغییر دادن شرایط آزمایش داشته باشند.

کروماتوگرافی مایع سریع پروتئین

کروماتوگرافی مایع سریع پروتئین (Fast Protein Liquid Chromatography) یک روش اختصاصی طراحی شده برای آنالیز پروتئین‌ها است. به دلیل استفاده از رزین‌ها و بافر‌های متنوع در سیستم کار این کروماتوگرافی، این روش به روشی کارآمد برای جداسازی بسیاری از ترکیبات پروتئینی با اندازه‌های مختلف و خالص‌سازی آنها بدل شده‌است. اساس کار این روش استفاده از بافر با فشار پایین و سرعت جریانی مناسب است. این روش در زمینه‌های تحقیقات زیست دارویی، مهندسی پروتئین و بسیاری از زمینه‌های دیگر کاربرد دارد.

این روش به محققان اجازه می‌دهد که ترکیبات پیچیده پروتئینی را با غلظت‌های بالا جداسازی کنند و به ساختار، میزان فعالیت، و برهم‌کنش آن‌ها پی‌ببرند. با این‌که این روش برای جداسازی و آنالیز پروتئین‌ها ساخته شده‌است، بر‌اساس احتیاج محققان می‌تواند برای سایر ترکیبات نیز بکار رود.

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا

کروماتوگرافی مابع با عملکرد بالا HPLC ،(High-Performance Liquid Chromatography) به عنوان پرکابردترین روش کروماتوگرافی مایع شناخته می‌شود. این روش به دلیل دقت بالا، کارایی بالا، حساسیت و توانایی جداسازی ترکیبات پیچیده مورد استفاده قرار می‌گیرد.

برای مثال فشار بالا در سیستم‌های HPLC این امکان را فراهم می‌کند که اجزای کوچک‌تری در ستون کروماتوگرافی استفاده شوند. این امر باعث می‌شود اجزای نمونه با دقت و سرعت بیشتری جدا شوند. این اجزای کوچکتر که معمولا اندازه‌ای برابر ۱۰ میکرومتر دارند در فاز متحرک حل شده‌اند و جداسازی بهتری را فراهم می‌کنند و سطح زیر نمودار بهتری در کروماتوگرام تحویل می‌دهند. این سیستم‌های کروماتوگرافی نسبت به سایر روش‌های کروماتوگرافی مایع با سرعت بیشتری عمل می‌کنند.

هرچند طی سال‌های گذشته‌ روش‌های جدید و بهتری نسبت به HPLC ابداع شده‌است. از این روش‌ها می‌توان به کروماتوگرافی عملکرد فشار فوق بالا UHPLC اشاره کرد که سرعت و دقت آن به مراتب بیشتر از روش HPLC است. همچنین به نسبت هدف محققان ممکن است روش‌های دیگر کروماتوگرافی برای انجام جداسازی و آنالیز انتخاب شود.

در شکل زیر یک نمونه ساده از دستگاه کروماتوگرافی HPLC را مشاهده می‌کنید.

انتخاب انواع ستون‌های HPLC

در کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا انواع متفاوتی از ستون استفاده می‌شود که بسته به نوع هدف آزمایش گوناگون هستند. ستون‌های C18 و C8 در کروماتوگرافی فاز معکوس برای ترکیبات هیدروفوبیک (آب گریز) استفاده می‌شوند. این در حالی است که در کروماتوگرافی تبادل یونی، ذرات باردار و در کروماتوگرافی اندازه طردی ذرات درشت مولکول مانند پروتئین‌ها جداسازی می‌شوند. انتخاب نوع ستون بسته به هدف جداسازی به محققان بستگی دارد و می‌تواند روی نتیجه عمل جداسازی نتیجه بسزایی داشته باشد.

کروماتوگرافی مایع عملکرد بسیار بالا

کروماتوگرافی عملکرد بسیار بالا UHPLC، (Ultra High-Performance Liquid Chromatography) پیشرفتی چشمگیر در سیستم‌های کروماتوگرافی مایع به حساب می‌آید. این سیستم نوآورانه در فشار‌های بالا عمل می‌کند (حدود ۱۲۰ مگاپاسکال یا ۱۲۰۰ اتمسفر).

همچنین، کروماتوگرافی عملکرد بسیار بالا از ستون‌های کروماتوگرافی با ذرات فوق ریز (حدود ۲ میکرومتر) استفاده می‌کند که به شدت کارایی جداسازی را افزایش می‌دهد.

این کوچک‌تر بودن اندازه ذرات ستون و استفاده از کروماتوگرافی مایع با فشار بالاتر باعث می‌شود دقت و سرعت جداسازی نسبت به سایر روش‌ها بسیار بالاتر باشد. نمودار کروماتوگرام این روش قله‌های تیزتر و حساس‌تری می‌دهد.

این ویژگی‌های کروماتوگرافی عملکرد بسیار بالا آن‌را به روشی کارآمد برای بسیار از زمینه‌ها تبدیل کرده است. برای مثال از این روش در آنالیز ترکیبات پیچیده و جداسازی در مقیاس وسیع استفاده می‌شود.حساسیت فوق العاده این روش آن‌ را برای استفاده در تحقیقات دارویی، پایش محیط زیستی و مطالعات بیومولکولی مناسب ساخته است.

سایر روش‌های کروماتوگرافی مایع

علاوه بر روش‌های ذکر شده، انواع دیگری از روش‌ها برای انجام کروماتوگرافی مایع وجود دارد که در ادامه به چند مورد آن‌ها اشاره می‌کنیم. فهرست زیر این چند روش‌ را معرفی می‌کند.

• کروماتوگرافی تقسیمی
• کروماتوگرافی مایع جامد
• کروماتوگرافی تبادل یونی (IEX)
• کروماتوگرافی اندازه طردی (SEC)
• کروماتوگرافی میل ترکیبی
• کروماتوگرافی کایرال

کروماتوگرافی تقسیمی

در این روش هر دو فاز ساکن و متحرک مایع هستند. این دو مایع نباید با یکدیگر مخلوط شوند.

کروماتوگرافی مایع جامد

این روش مشابه روش کروماتوگرافی تقسیمی است با این تفاوت که فاز ساکن با سیلیکای سخت یا ترکیبی بر مبنای سیلیکا جایگزین شده‌است. گاهی وقت‌ها فاز ساکن ممکن است آلومینا باشد. آنالیت‌هایی که در فاز متحرک هستند با آن واکنش داده و بیشتر به فاز ساکن تمایل دارند و به آن جذب می‌شوند و آنهایی که اینگونه نیستند همراه فاز متحرک جدا می‌شوند. هردو گونه‌ی فاز نرمال و معکوس این روش قابل انجام هستند.

کروماتوگرافی تبادل یونی (IEX)

کروماتوگرافی تبادل یونی روش جداسازی بسیار کارآمد برای جداسازی ترکیبات مایع و اندازه‌گیری غلظت آن‌هاست. این روش برای جداسازی یون‌ها بر روی ستون‌هایی که ظرفیت تبادل یون بالایی ندارند انجام می‌گیرد. این روش بر مبنای تعادل تبادل یون بین محلول و یون‌های مختلفی که در فاز ساکن هستند و می‌توانند با بکدیگر جفت شوند صورت می‌گیرد.

این فاز ساکن می‌تواند یک گروه یونی با بار کلی مثبت یا منفی باشد. برای مثال گروه‌های سولفونات $$SO_3^-$$ یا آمین ۴ تایی $$-{N (CH_3)_3}^+$$ به عنوان آنیون و کاتیون در این ستون‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرند. این روش‌ در صنعت‌های مختلف آنالیز محیط زیست، تولیدات مختلف، تضمین کیفیت مواد غذایی، تحقیقات صنایع دارویی و تحقیقات شیمیایی کاربرد دارد. در این روش، فاز ساکن از مقادیر زیادی گروه اسیدی که به رزین پلیمری متصل شده‌اند، تشکیل شده‌است.

فاز متحرک در این روش معمولا یک بافر آبی است مانند نمک‌های غیرآلی که در حلالی مناسب حل شده‌اند.

کروماتوگرافی تبادل یونی دو گونه‌ی مختلف دارد. کروماتوگرافی تبادل کاتیون و کروماتوگرافی تبادل آنیون این دو روش هستند. کروماتوگرافی تبادل کاتیون یون‌های مثبت را نگه می‌دارد و کروماتوگرافی تبادل آنیون یون‌های منفی را نگه می‌دارد.

کروماتوگرافی اندازه طردی (SEC)

کروماتوگرافی اندازه طردی که به آن کروماتوگرافی نفوذ ژل یا کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون هم گفته می‌شود روشی ویژه جداسازی بر‌اساس اندازه مولکول‌ها است. این روش کروماتوگرافی مولکول‌ها را بر‌اساس اندازه‌شان جداسازی می‌کند. این عمل با ساخت ستون فاز ساکن به روشی که ذرات سیلیکا یا پلیمر آن منافذ یکنواختی تشکیل دهند صورت میگیرد.

مولکول‌های کوچک‌تر همراه فاز متحرک درون سیلیکا گیر می‌افتند و با سرعت کمتری از مولکول‌هایی که اندازه بزرگتری دارند شسته می‌شوند. بنابراین، سرعت جداسازی ذرات بستگی به اندازه آنها دارد. ذرات بزرگتر با سرعت بیشتر و ذرات کوچکتر با سرعت کمتر شسته می‌شوند. همچنین باید توجه داشت که بین ذرات نمونه و فاز ساکن در این روش هیچ برهم‌کنش فیزیکی یا شیمیایی رخ نمی‌دهد و فقط اندازه ذرات دخیل هستند. این روش کروماتوگرافی برای جداسازی موادی مانند پلیمر‌ها و پروتئین‌ها که اندازه مولکول نقشی اساسی را در ویژگی‌ها و کارایی مواد دارد بسیار کارآمد است.

محققان از این روش برای شناسایی و خالص‌سازی ماکرومولکول‌ها استفاده می‌کنند و با آن به اطلاعات ارزشمندی درباره پراکندگی وزنی آن‌ها، وضعیت انباشتگی و ویژگی‌های ساختاری این مواد دست می‌یابند.

این روش کروماتوگرافی به دلیل کارایی بسیار آن باعث شده در صنعت‌های مختلفی همچون شیمی پلیمر، بیوتکنولوژی‌، بیوشیمی، علم مواد، تحقیقات دارویی و مطالعات بیومولکولی استفاده شود.

کروماتوگرافی میل ترکیبی

کروماتوگرافی میل ترکیبی شامل تشکیل پیوند ماده با مولکول‌های آنالیت در نمونه است. بعد از تشکیل پیوند، تنها مولکول‌هایی که این پیوند را دارند در ستون باقی خواهند‌ماند و باقی مولکول‌ها همراه فاز متحرک از ستون خارج خواهند شد. فاز ساکن در این روش معمولا آگاروز یا دانه‌های متخلخل شیشه‌ای است که می‌تواند حرکت مولکول‌های پیوند‌شده را محدود کند. همچنین می‌توان میزان و نوع شسته شدن را با تغییر دادن اسیدیته یا قدرت یونی پیوند‌ها تغییر داد. این روش معمولا در بیوشیمی برای خالص‌سازی پروتئین‌ها کاربرد دارد.

کروماتوگرافی کایرال

کروماتوگرافی کایرال روشی است که به ما کمک می‌کند تا مخلوط‌های راسمیک را به اجزای انانتیومر آنها جداسازی کنیم. ترکیب کایرال در این روش می‌تواند به فاز ساکن یا متحرک اضافه شود. معمولا اضافه کردن ترکیب کایرال به فاز ساکن بیشتر استفاده می‌شود.

یادگیری مهندسی شیمی با فرادرس

یکی از مباحثی که در بسیاری از دروس مهندسی شیمی فراگرفته می‌شود شیمی تجزیه پیشرفته و شیمی تجزیه دستگاهی است. شیمی تجزیه دستگاهی به بررسی و تجزیه‌ مواد، ترکیبات، عناصر و ترکیبات آلی و غیرآلی می‌پردازد و دستگاه‌های موجود برای انجام این آزمایشات را معرفی می‌کند. یکی از روش‌های تجزیه دستگاهی کروماتوگرافی مایع است. با این تکنیک‌ها ترکیبات جداسازی، شناسایی و اندازه‌گیری شده و ساختار و خصوصیات آن‌ها بررسی می‌شود. همچنین این مطلب به آموزش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا نیز می‌پردازد. این اطلاعات می‌تواند در زمینه‌های مختلفی مانند علم داروسازی، محیط زیست، کشاورزی، شیمی صنعتی مفید واقع شود.

پیشنهاد می‌کنیم از مجموعه فیلم آموزشی مهندسی شیمی فرادرس برای یادگیری اصولی قوانین و مفاهیم طیف سنجی بهره ببرید.

در این مجموعه آموزش از فرادرس به ارائه دروس مربوط به شیمی مهندسی پرداخته‌ شده‌است. هم‌چنین برای دسترسی به آموزش‌های مرتبط می‌توانید روی لینک‌های زیر کلیک کنید.

• فیلم آموزش کروماتوگرافی گازی
• فیلم آموزش آشنایی با روش‌های دستگاهی در شیمی تجزیه
• فیلم آموزش روش‌های بیوشیمی و بیوفیزیک

تکنیک‌های پیشرفته در کروماتوگرافی مایع

تکنیک‌های پیشرفته بسیاری برای افزایش حساسیت و دقت روش‌های کروماتوگرافی مایع وجود دارد که در ادامه به چند مورد از مهم‌ترین آن‌ها اشاره می‌کنیم. لیست زیر چند نمونه از تکنیک‌های پیشرفته در کروماتوگرافی مایع را مشخص می‌کند.

• کروماتوگرافی مایع - طیف سنجی جرمی
• کروماتوگرافی وضوح بالا
• کروماتوگرافی چندبعدی

کروماتوگرافی مایع - طیف سنجی جرمی

کروماتوگرافی مایع - طیف سنجی جرمی Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS) یکی از قدرتمندترین روش‌های تجزیه است. این روش ویژگی‌های مولکول‌ها را بر‌اساس نسبت جرم به بار آنها مشخص می‌کند. این روش شامل یونیزه کردن مولکول‌ها و اندازه‌گیری نسبت جرم به بار یون‌های تشکیل شده‌است. با انجام این کار اطلاعات مهمی درباره موقعیت عنصر و ساختار ترکیب به دست می‌آید.

وقتی این روش با روش کروماتوگرافی مایع ترکیب می‌شود روش (LC-MS) کارایی بیشتری پیدا می‌کند. کروماتوگرافی مایع روش جداسازی انتها به ابتدا است که ترکیبات پس از جداسازی به طیف سنج جرمی هدایت می‌شوند. این روش مزیت‌های بسیاری دارد که در ادامه به دو مورد آن اشاره شده‌است.

• آنالیز بهبودیافته ترکیبات پیچیده
  روش (LC-MS) امکان استفاده برای ترکیبات بسیار پیچیده را دارد. کروماتوگرافی این ترکیبات را از یکدیگر جدا می‌کند و این ترکیبات عاری از پیچیدگی قبلی وارد طیف سنج جرمی می‌شوند. این عمل باعث افزایش حساسیت آنالیز می‌شود.
• دست یابی به اطلاعات ساختاری ترکیبات
  کروماتوگرافی مایع طیف سنج جرمی اطلاعات ساختاری ارزشمندی را در مورد ترکیبات آنالیز شده در اختیار محققان قرار می‌دهد. اطلاعات منتشر شده توسط طیف سنج جرمی اطلاعاتی درمورد فرمول مولکولی، الگوی جزئی ساختار و گروه‌های مولکولی را در اختیار قرار می‌دهد.

کروماتوگرافی وضوح بالا

تکنیک کروماتوگرافی وضوح بالا جداسازی فوق حرفه‌ای و شناسایی بهتری را نسبت به سایر روش‌ها ارائه می‌کند. در این روش پیک‌ها (قله‌های) نمودار کروماتوگرام باریک‌تر و دقیق‌تر هستند و وضوح بهتری دارند و این مسئله باعث می‌شود شناسایی بهتر انجام شود.

کروماتوگرافی چندبعدی

این روش کروماتوگرافی تکنیکی پیچیده برای جداسازی است که از ترکیب دو یا چند تکنیک کروماتوگرافی در آن استفاده می‌شود. این روش بیشتر برای جداسازی ترکیبات پیچیده‌ای استفاده می‌شود که جداسازی آن‌ها با استفاده از یک روش کروماتوگرافی امکان‌پذیر نباشد. ایده‌ این روش کروماتوگرافی این است که از چند مکانیزم جداسازی عمودبرهم استفاده شود. هر بعد جداسازی (برای مثال اندازه طردی، فاز معکوس، تبادل یونی) نتایج متفاوتی به دست می‌دهد که همگی می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند.

این روش در زمینه‌هایی مانند پروتئین شناسی، متابولومیکس، و برخی از آنالیز‌های پیچیده دارویی کاربرد دارد. با ترکیب چند بعد از کروماتوگرافی، محققان می‌توانند به اطلاعات ارزنده‌ای درباره ترکیبات پیچیده، شناسایی ترکیبات کمیاب و بیومولکول‌ها دست یابند.

کابرد‌های کروماتوگرافی مایع در صنایع

کروماتوگرافی مایع در زمینه‌های متعددی کاربرد دارد که برای هریک از روش‌ها به صورت جداگانه به اختصار به آنها اشاره شد. در ادامه این مطلب از مجله فرادرس در چند دسته‌بندی به کاربرد‌های کلی این روش جداسازی می‌پردازیم. در ادامه لیست کاربرد‌های کروماتوگرافی مایع را در صنایع مختلف آورده‌ایم.

• صنایع داروسازی
• بیوتکنولوژی و زیست‌داروشناسی
• آنالیز محیط زیست
• صنایع غذا و نوشیدنی
• پزشکی قانونی
• تحقیقات آزمایشگاهی تشخیص طبی

داروسازی

کروماتوگرافی مایع نقشی اساسی را در پیشرفت صنایع داروسازی ایفا می‌کند. این تکنیک همچنین در بخش‌های کنترل کیفیت دارو‌ها و فارماکوکینتیک نیز کاربرد دارد. این روش برای آنالیز ترکیبات داروها، متابولیت‌ها، ناخالصی‌ها و غلظت دارو‌ها در فرمولاسیون دارویی و نمونه‌های بیولوژیک استفاده می‌شود.
این روش‌ها شامل اندازه‌گیری دارو در متابولیت‌های خون، پلاسما و ادرار باعث درک میزان جذب، پراکندگی متابولیسم و دفع آنها در بدن می‌شود.

بیوتکنولوژی و زیست‌داروشناسی

کروماتوگرافی مایع برای آنالیز بیومولکول‌ها مانند پروتئین‌ها، پپتید‌ها، نوکلئیک اسید‌ها، کربوهیدارت‌ها، آنتی‌بادی‌ها و واکسن‌ها بکار می‌رود. این روش‌جداسازی به طور بخصوص برای شناسایی و اندازه‌گیری خلوص این مولکول‌ها استفاده می‌شود.

آنالیز محیط زیست

کروماتوگرافی مایع برای اندازه‌گیری آلودگی‌های محیط زیستی، آفت‌ها، آلودگی‌های خاک، آب و هوا استفاده می‌شود.

صنایع غذا و نوشیدنی

کروماتوگرافی مایع برای اندازه‌گیری افزودنی ‌های مواد غذایی، میکروب‌ها، قارچهای مایکوتوکسین و سایر آلودگی‌های مواد غذایی استفاده می‌شود.

پزشکی قانونی

مانند صنایع دارویی در پزشکی قانونی نیز از کروماتوگرافی مایع برای اندازه‌گیری دارو‌ها‌، سم‌ها، متابولیت‌های ارگان‌ها و غیره استفاده می‌شود. این آزمایشات برای تحقیقات جنایی مورد استفاده قرار می‌گیرند.

تحقیقات آزمایشگاهی تشخیص طبی

کروماتوگرافی مایع در آزمایشگاه‌ها نیز برای اندازه‌گیری دارو‌ها، ترکیبات خطرناک و غیره استفاده می‌شود.

نظریه بشقابک‌های فرضی و نظریه سرعت

نظریه بشقابک‌های فرضی و نظریه سرعت دو نظریه مهم در کروماتوگرافی هستند. نظریه بشقابک‌های فرضی بیان می‌کند که در سیستم کروماتوگرافی بین فاز متحرک و ساکن تعادل برقرار است. بر‌اساس این نظریه فرض می‌شود که ستون کروماتوگرافی به بشقابک‌های متعددی تقسیم شده‌است. هرچه تعداد این بشقابک‌ها افزایش یابد ارتفاع ستون افزایش می‌یابد، جداسازی اجزای نمونه نیز طول می‌کشد. این نظریه همچنین معادله‌ای بر‌اساس کروماتوگرام برای بدست آوردن حجم و کارایی ستون ارائه می‌کند.

$$HETP=L\div N$$

در این معادله، $$L$$ طول ستون و $$N$$ تعداد بشقابک‌ها است.

در نظریه سرعت، مهاجرت مولکول‌ها در ستون بررسی می‌شود. این عامل به شکل ذرات، گسترش و انتشار آن‌ها بستگی دارد. نظریه سرعت با معادله‌ی واندیمتر تعریف می‌شود که در آن بهترین پیش بینی از پاشش در کروماتوگرافی مایع در ستون‌ها به دست می‌آید. این معادله این‌که نمونه چه روش‌هایی برای طی کردن طول ستون کروماتوگرافی دارد را بررسی می‌کند. با استفاده از معادله واندیمتر می‌توان میزان بهینه شتاب و کمترین ارتفاع بشقابک‌های فرضی را به دست آورد.

$$H=A+\dfrac{B}{u} = Cu \nonumber$$

در معادله بالا $$A$$ نفوذ «ادی» (Eddy diffusion)  $$B$$ نفوذ طولی $$C$$ میزان جرم جابه‌جا شده و $$U$$ شتاب خطی است.

• A نفوذ ادی Eddy diffusion

وقتی فاز متحرک از ستونی که با فاز ساکن پرشده عبور می‌کند، مولکول‌های حل شونده مسیرهای مختلف تصادفی در فاز ساکن خواهند داشت. این مسیرهای مختلف طول مسیر متفاوتی خواهند داشت و در نتیجه سبب پهن شدگی باند حل‌شونده می‌شوند.

• B نفوذ طولی

غلظت آنالیت در لبه‌ها کمتر از مرکز باند است و مولکول‌ها از مرکز به سمت کناره‌ها انتشار می یابند. که این پدیده نیز سبب پهن شدگی پیک می‌شود. اگر سرعت فاز متحرک آنقدر بالا باشد که آنالیت زمان کمی را در ستون صرف کند اثرات این نوع نفوذ کاسته شده و پهن شدگی کمتر می‌شود.

تاریخ اختراع روش کروماتوگرافی

کروماتوگرافی روشی تاثیرگذار برای جداسازی اجزای مختلف یک ترکیب در تحقیقات برای شناسایی، اندازه‌گیری و آنالیز این اجزا است. کروماتوگرافی در معنی لغوی به معنای رنگ‌شناسی است. اولین تعریف کروماتوگرافی به دانشمند روسی به نام میخاییل تسوت برمی‌گردد. او دو ستون کلسیم کربنات را برای جداسازی اجزای گیاهان در تحقیقش درباره کلروفیل استفاده کرد. این اتفاق در سال ۱۹۰۱۱ (اوایل قرن ۲۰ ) افتاد.

پیشرفت‌های بیشتر در علم کروماتوگرافی زمانی اتفاق افتاد که دو دانشمند جان پاتر مارتین و ریچارد سینج در سال ۱۹۵۲ جایزه نوبل را از آن خود کردند. آنها توانستند روش کروماتوگرافی تقسیمی و نظریه بشقابک‌های فرضی را بیان کنند. روش‌های مختلفی برای انجام آزمایش کروماتوگرافی وجود دارد. کروماتوگرافی گازی، کروماتوگرافی مایع‌، کروماتوگرافی لایه نازک، کروماتوگرافی کاغذی و ... همگی روش‌ها و مزیت‌ها و معایب خود را دارند که با توجه به نوع نمونه‌ی مورد آزمایش‌ می‌توانند مورد استفاده قرار بگیرند.

جمع‌بندی

کروماتوگرافی مایع یک روش جداسازی با قابلیت‌های متعدد است که در بیشتر صنایع استفاده بسیاری دارد. این تکنیک به محققان قابلیت جداسازی، شناسایی، و آنالیز را در زمینه‌های مهمی مانند پیشرفت‌های دارویی، پایش محیط زیست و ... می‌دهد.

حساسیت و دقت بالای روش‌های کروماتوگرافی مایع باعث شده بتوان ترکیبات پیچیده را به راحتی و در زمان کم جداسازی و شناسایی کرد.