کروماتوگرافی ستونی چیست؟ — به زبان ساده

کروماتوگرافی ستونی (Column Chromatography) از تکنیک‌های جذبی جداسازی مواد در شیمی تجزیه است که در آن ترکیبات نمونه در بالای ستونی حاوی جاذب قرار می‌گیرند و با سرعت‌های مختلف از آن خارج و جدا می‌شوند. این تکنیک را می‌توان در مقیاس آزمایشگاهی و صنعتی برای خالص‌سازی و جداسازی موادی استفاده کرد. در کروماتوگرافی ستونی، فاز ساکن جامد و فاز متحرک مایع است.

کروماتوگرافی ستونی چیست ؟

کروماتوگرافی ستونی یکی از روش‌های جداسازی در کروماتوگرافی است. ترکیبات در این روش بسته به میزان سرعتی که در فاز ساکن دارند از ستون خارج می‌شوند. کروماتوگرافی ستونی در مقیاس‌های بسیار کمِ میکروگرم تا کیلوگرم کاربرد دارد. مزیت اصلی کروماتوگرافی ستونی ارزان و یکبار مصرف بودن فاز ساکن است. اینکه فاز ساکن تنها یک بار مورد استفاده قرار می‌گیرد از آلوده شدن و تخریب آن در فرایند بازیافت جلوگیری می‌شود.

فیلم آموزش کروماتوگرافی گازی Gas Chromatography در فرادرس

کلیک کنید

کروماتوگرافی ستونی از جمله تکنیک‌های آماده‌سازی است. در جداسازی به روش کروماتوگرافی، تکنیک‌ها به دو دسته آنالیزی و آماده‌سازی دسته‌بندی می‌شوند. در کروماتوگرافی آماده‌سازی، جداسازی انجام شده برای استفاده‌های بیشتر است درحالی‌که در کروماتوگرافی آنالیزی، اندازه‌گیری نسبت ترکیبات صورت می‌گیرد. از این روش برای جداسازی و خالص‌سازی ترکیبات براساس قطبی یا غیرقطبی بودن آن‌ها می‌توان استفاده کرد. اندازه ستون در این نوع از کروماتوگرافی قابل تغییر است و می‌تواند اندازه‌های گوناگونی داشته باشد. تفاوت در «ضریب تقسیم» (Partition Coefficient | P) مواد موجود در مخلوط، جداسازی را ممکن می‌کند. با استفاده از این شاخص می‌توان میزان آب‌دوستی یا آب‌گریزی ترکیب را مشخص کرد.

بهبود و توسعه کروماتوگرافی ستونی ساده برخی از روش‌های کروماتوگرافی پیشرفته که در زیر فهرست شده‌اند را ایجاد کرده است.

• کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC)
• کروماتوگرافی گازی (GC)
• کروماتوگرافی تبادل یونی (IEC)
• کروماتوگرافی ژل تراوشی (GPC)

اجزای کروماتوگرافی ستونی

اجزای تشکیل‌دهنده کروماتوگرافی ستونی ساده به صورت زیر است.

• ستون کروماتوگرافی
• فاز ساکن
• فاز متحرک

ستون کروماتوگرافی چیست ؟

طول ستون در کروماتوگرافی ستونی مایع ۲۵ تا ۵۰ سانتی‌متر و قطر داخلی آن ۴ میلی‌متر است. ستون‌ها را معمولاً از فولاد ضدزنگ می‌سازند. در کروماتوگرافی ستونی گازی، ستون ۱-۳ متر طول و ۲-۴ میلی‌متر قطر داخلی دارد. جنس این ستون از شیشه یا فولاد ضدزنگ است. برای افزایش کارایی کروماتوگرافی، همزمان از چند ستون استفاده می‌کنند.

فاز ساکن

در کروماتوگرافی ستونی فاز ساکن از جنس جامد است که معمولاً به شکل پودر، ژل یا برای افزایش سطح تماس بیشتر از ذرات میکرومتخلخل استفاده می‌شود. سیلیکاژل $$(SiO_2)$$ و آلومینا $$(Al_2O_3)$$ دو نمونه رایج از فاز‌های ثابت برای کروماتوگرافی ستونی هستند. پیش‌تر از سلولز $$(C_6H_{10}O_5)$$ نیز برای فاز ساکن استفاده می‌شد.

بین وزن ماده جامدِ فاز ساکن و مخلوط خشک آنالیت نسبت مهمی وجود دارد. برای ستون حاوی سیلیس این نسبت بین ۲۰:۱ تا ۱۰۰:۱ است و به نزدیکی اجزای آنالیت در حال شویش بستگی دارد. اندازه ذرات فاز ساکن با توجه به نوع ستون متفاوت است.

برخی از معیارهای ماده جامد که جذب خوبی می‌تواند داشته باشد به ترتیب زیر است:

• شکل و اندازه ذرات در محدوده ۶۰–۲۰۰ میکرومتر و شکل‌هایی یک‌دست دارند.
• ذرات پایداری بالایی دارند و نسبت به ترکیبات شیمیایی بی‌اثر هستند. بین این ذرات و حلال‌ها واکنشی صورت نمی‌گیرد.
• ارزان قیمت، بدون رنگ و در دسترس باشند.
• حلال به راحتی باید از میان آن جریان یابد.

براساس میزان جذب ماده فاز ساکن، آن‌ها به دسته‌های ضعیف، متوسط و قوی تقسیم می‌شوند.

فاز متحرک

همچنین می‌توان از پمپ‌های هوا یا حاوی گاز‌های فشرده‌ای چون نیتروژن یا آرگون برای افزایش نرخ جریان بهره برد. در روش «کروماتوگرافی ستونی فلش» (Flash Column Chromatography) از پمپ‌های هوا برای افزایش سرعت جریان استفاده می‌شود.

فیلم آموزش مقدماتی شیمی تجزیه دستگاهی در فرادرس

کلیک کنید

انواع کروماتوگرافی

در کروماتوگرافی دو فاز ساکن و متحرک وجود دارد که فاز ساکن به صورت ستون، صفحه یا کاغذ است. فاز متحرک نیز به شکل گاز، مایع یا سیال فوق بحرانی است.

براساس نوع فاز متحرک، کروماتوگرافی به صورت زیر دسته‌بندی می‌شود.

• کروماتوگرافی مایع (LC)
• کروماتوگرافی گازی (GC)
• کروماتوگرافی سیال ابر بحرانی (SFC)

و براساس فاز ساکن به صورت زیر این تکنیک تقسیم می‌شود.

• کروماتوگرافی ستونی (LSC)
• کروماتوگرافی کاغذی (PC)
• کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

انواع کروماتوگرافی ستونی چیست ؟

کروماتوگرافی ستونی را می‌توان به چهار دسته جذبی،  تقسیمی، ژل و تبادل یونی تقسیم کرد:

• «جذبی» (Adsorption) : در این روش، اجزای مخلوط روی بستر جاذب ستون، جذب می شوند.
• «تقسیمی» (Partition) : در تکنیک تقسیمی، فازهای ساکن و متحرک، هر دو در یک فاز و به شکل مایع هستند.
• «ژل» (Gel): در کروماتوگرافی ستونی ژل، ستون کروماتوگرافی با استفاده از ژل پر شده است.
• «تبادل یونی» (Ion exchange): در این نوع از کروماتوگرافی ستونی، فاز ساکن همیشه از نوع رزین‌های تبادل یونی است.

اساس کروماتوگرافی ستونی

پایه و اساس کروماتوگرافی ستونی به ویژگی جذب مواد مرتبط است. به طور کلی، موادی که میل بیشتری به فاز ساکن دارند با حرکت آهسته‌تر و موادی که میل کمتری دارند سریع‌تر از ستون خارج یا حذف می‌شوند.

مراحل کروماتوگرافی ستونی به شرح زیر است:

• آماده‌سازی ستون: برای جداسازی فاز مناسبی انتخاب و در انتهای ستون پشم شیشه قرار می‌گیرد. ستون نیز به دو روش آماده می‌شود.
  • روش خشک: به مقدار نیاز ستون با پودر جاذب پر شده و سپس برای همگن شدن با حلال شسته می‌شود.
  • روش خیس یا مرطوب: جاذب یا فاز ساکن به همراه فاز متحرک به شکل «دوغاب» (Slurry) تهیه و در ستون قرار می‌گیرد.
• افزودن نمونه: نمونه مخلوطی از ترکیبات مختلف است. برای افزودن نمونه به ستون، نمونه باید در مقداری از حلال به صورت رقیق حل شده و سپس به بالای فاز ساکن اضافه می‌شود.
• شویش: پس از افزودن نمونه، حلال شستسو اضافه و فرایند جداسازی آغاز می‌شود. عمل شویش معمولا به دو طریق می‌تواند صورت گیرد.
  1. «تکنیک شویش ایزوکراتیک» (Isocratic Elution Technique): از حلالی یکسان یا حلالی با قطبیت مشابه در کل فرایند مورد استفاده قرار گیرد. برای نمونه تنها از کلروفرم استفاده شود.
  2. «تکنیک شویش گرادیان» (Gradientelution Technique): با پیشرفت فرایند، از حلال‌هایی با قطبیت بیشتر استفاده می‌شود. مثلاً به ترتیب از بنزن< کلروفرم< اتیل استات< کلروفرم استفاده می‌کنند. در شویش گرادیانی در ابتدا ترکیب‌های غیرقطبی و سپس ترکیبات قطبی جدا می‌شوند.
• شناسایی: وقتی که اجزای جدا شده رنگ داشته باشند با چشم و بدون نیاز به ابزار می‌توان شناسایی و جدا کردن آن‌ها را انجام داد. اما اگر ترکیبات بی‌رنگ باشند، اجزای جدا شده با شماره‌گذاری جز به جز جمع‌آوری شده و در نهایت برای شناسایی توسط TLC آنالیز می‌شوند. در نهایت غلظت نمونه بر حسب زمان به صورت «کروماتوگرام» (Chromatogram) توسط آشکارساز رسم می‌شود. از میزان وضوح کروماتوگرام می‌توان به کیفیت فرایند پی برد. وضوح بالاتر نشانه جداسازی بهتر است.

معایب و مزایای کروماتوگرافی ستونی

برخی از مزیت‌ها و معیایب این روش عبارتند از:

مزایای کروماتوگرافی ستونی

• جداسازی هر نوع مخلوطی به هر میزانی ممکن است.
• گزینش فاز متحرک تنوع زیادی وجود دارد.
• محدودیتی برای میزان مخلوط جداسازی وجود ندارد.
• آنالیت‌های جدا شده می‌توانند دوباره استفاده شوند.
• امکان خودکارسازی فرایند وجود دارد.

معایب کروماتوگرافی ستونی

• فرایند جداسازی به آهستگی انجام می‌شود و زمان زیادی نیاز است.
• در فرایند جداسازی ممکن است به حلال بیشتری نیاز باشد و می‌تواند هزینه اضافی به همراه داشته باشد.
• خودکارسازی فرایند نیز می‌تواند هزینه‌بر و پیچیده باشد.
• قدرت تفکیک بالایی ندارد.

کاربرد کروماتوگرافی ستونی چیست ؟

از کروماتوگرافی ستونی به عنوان روشی مفید برای جداسازی و خالص‌سازی جامدات و مایعات بهره می‌گیرند. این روش را می‌توان برای جداسازی دسته‌های زیادی از دارو‌ها و گلیکوزید‌ها، عصاره‌های گیاهی، آلکالوئید‌ها، آمینو اسیدها استفاده کرد. همچنین از عصاره‌های خام می‌توان ترکیبات فعال و ترکیبات ضروری عصاره گیاهی را جدا کرد.

رایج‌ترین کاربردهای این تکنیک عبارتند از:

• جداسازی ترکیبات گوناگون
• حذف ناخالصی‌ها
• جداسازی اجزای فعال
• جداسازی متابولیت‌ها از مایعات بیولوژیکی
• ارزیابی و برآورد داروها در فرمول‌بندی یا عصاره‌های خام
• جداسازی ترکیبات فعال گیاهان

فیلم آموزش شناسایی ترکیبات آلی – جامع و کاربردی در فرادرس

کلیک کنید

سوالات متداول

برخی از پرسش‌های رایج در این بخش پاسخ داده شده‌اند.

کروماتوگرافی ستونی به چه عواملی بستگی دارد ؟

عوامل زیر می توانند بر کارایی ستون تاثیر بگذارند.

• ابعاد ستون
• اندازه ذرات جاذب
• ماهیت حلال
• دمای ستون
• فشار

در کروماتوگرافی ستونی از چه حلالی استفاده می‌شود؟

در کروماتوگرافی ستونی معمولاً مخلوطی از حلال‌های قطبی و غیرقطبی استفاده می‌شود تا به‌توان جداسازی ترکیبات گوناگون را انجام داد. حلال‌های آلی هگزان و اتیل استات برای مواد قطبی و متانول و محلول‌های آبی برای مواد غیرقطبی رایج‌ترین حلال‌های مورد استفاده در این تکینک هستند.