فلورسانس چیست؟ — به زبان ساده

فلورسانس نوعی خاصیت نورتابی (لومینسانس) است که در سیستم‌های شیمیایی گازی، مایع یا جامد بوقوع می‌پیوندد. فلورسانس در اثر جذب فوتون در حالت پایه و رسیدن به حالت برانگیخته بوجود می‌آید. بر خلاف فسفرسانس، در این حالت، اسپین الکترون همچنان با الکترون حالت پایه، جفت شده است. زمانی که مولکول برانگیخته، به حالت پایه بازگردد، تابش فوتون‌هایی با انرژی کمتر و طول موج بلندتر را به همراه دارد.

بارزترین نمونه در خصوص فلورسانس زمانی است که تابش جذب شده در محدوده ماورا بنفش و برای انسان نامرئی باشد در حالیکه نور گسیل شده در طیف مرئی جای بگیرد. در این صورت، اگر ماده فلورسنت در معرض یک لامپ UV قرار بگیرد، رنگ بسیار واضحی را بدست می‌دهد. برخلاف مواد فسفرسانس، مواد فلورسنت به محض توقف منبع تابش، درخشش خود را از دست می‌دهند.

مقدمه ای بر فلورسانس

فلورسانس کاربردهای عملی بسیار زیادی در کانی‌شناسی، «گوهرشناسی» (Gemology)، پزشکی، طیف‌سنجی فلورسانس، شناسایی مولکول‌های زیستی و ... دارد. از کاربردهای روزمره فلورسانس می‌توان به بهره‌گیری از آن در لامپ‌های فلورسنت و LED اشاره کرد. در این لامپ‌ها، پوششی از جنس فلورسنت بکار رفته است که طول‌ موج‌های کوتاه نور ماورا بنفش یا آبی را به طول موج‌های بلندتر با رنگ زرد تبدیل می‌کند تا رنگ و جلوه‌ای همچون لامپ‌های پرمصرف حبابی داشته باشند. این خاصیت همچنین در طبیعت نیز یافت می‌شود.

فیلم آموزش روش های بیوشیمی و بیوفیزیک در فرادرس

کلیک کنید

تاریخچه فلورسانس

مشاهدات اولیه فلورسانس در سال‌های 1560 و 1565 انجام شد که در اثر خیساندن نوعی چوب درخت مشاهده شده بود. ترکیب شیمیایی که موجب این فلورسانس شده، موسوم به «ماتلالین» (Matlaline)، فرآورده ناشی از اکسایش فلاونوئیدهای (Flavonoids) موجود در چوب بود. بعدها طی سال‌های 1819 تا 1822، دانشمندان بسیاری این پدیده را توصیف کردند. در سال 1852، «جورج گابریل استوک» (George Gabriel Stokes) در مقاله خود با موضوع تغییر طول موج، به توضیح توانایی فلورسپار (فلوئوریت) و شیشه اورانیوم در تغییر طول موج نور مرئی پرداخت. او این پدیده را فلورسانس نام‌گذاری کرد.

خواص فیزیکی فلورسانس

فلورسانس با آزاد شدن انرژی همراه است. این پدیده زمانی اتفاق می‌افتد که یک الکترون از مولکول، اتم یا نانوساختار به حالت پایه خود برگردد و فوتونی از یک «حالت سینگلت» (Singlet State) برانگیخته آزاد کند.

• برانگیختگی: $${\displaystyle S_{0}+h\nu _{ex}\to S_{1}}$$
• تابش فلورسانس: گرما $${\displaystyle S_{1}\to S_{0}+h\nu _{em}+{\text{}}}$$

فیلم آموزش شناسایی و تعیین ساختار نانومواد 1 در فرادرس

کلیک کنید

باندهای فلورسنت، طول موجی بلندتر از خط رزونانس دارند. این جابجایی به سمت طول موج بلندتر، موسوم به «جابجایی استوکس» (Stokes Shift) است. حالات برانگیخته، عمر کمی در حدود $$10 ^ {- 8 }$$ ثانیه دارند. ساختار مولکولی و محیط شیمیایی،‌ بر خاصیت نورتابی تاثیر گذار هستند. در حقیقت، این دو عامل، شدت یک تابش را تعیین می‌کنند.

تصویر بالا، دیاگرام انرژی «جابلونسکی» (Joblonski) را در فلورسانس نشان می‌دهد. فلش بنفش‌رنگ، نشان‌دهنده جذب نور است. فلش سبزرنگ نیز نشان‌دهنده «آسایش ارتعاشی» (Vibrational Relaxation) است. این نوع از آسایش به صورت تابش پرتو نیست چراکه انرژی برانگیختگی به صورت ارتعاش یا گرما پخش می‌شود و هیچ فوتونی گسیل نخواهد شد.

بهره کوانتومی فلورسانس

بهره کوانتومی فلورسانس به عنوان نشان‌دهنده بازده فرآیند فلورسانس به شمار می‌آید. این بهره را به صورت نسبت فوتون گسیل شده به فوتون جذب شده تعریف می‌کنند:

فوتون جذب شده / فوتون گسیل شده =  $$\Phi$$

بیشینه مقدار بهره کوانتومی برابر با ۱۰۰ درصد یا ۱ است به این معنی که در اثر جذب هر فوتون، یک فوتون گسیل خواهد شد. ترکیباتی که بهره‌ای در حدود 10 درصد داشته باشند به عنوان ترکیبات فلورسانس شناخته می‌شوند. در تعریفی دیگر، بهره فلورسانس را می‌توان به صورت نرخ واپاشی حالت برانگیخته بیان کرد:

$$\Phi = \frac{ { k}_{ f} }{ \sum_{i}{ k}_{i } }$$

عمر فلورسانس

عمر فلورانس به متوسط زمانی می‌گویند که مولکول‌ها قبل از گسیل فوتون، در حالت برانگیخته قرار دارند. لازم به ذکر است که فلورسانس از سینتیک مرتبه اول پیروی می‌کند که رابطه آن در زیر آورده شده است:

$${\displaystyle \left [S _ { 1 } \right ] = \left [ S _ { 1 } \right ] _ { 0} e ^ { -\Gamma t } }$$

• $$\left [S _ { 1 } \right ]$$: غلظت مولکول‌ها در حالت برانگیخته و زمان t
• $$\left [ S _ { 1 } \right ] _ { 0}$$: غلظت اولیه
• $$\Gamma$$: سرعت واپاشی

فرآیندهای مختلف تابشی و غیرتابشی وجود دارند که حالات برانگیخته را تحت تاثیر قرار می‌دهند. بنابراین، سرعت واپاشی کل، مجموع همه سرعت‌های تابشی و غیر تابشی است:

$$\Gamma _ {tot} = \Gamma _ {rad} + \Gamma _ {nrad}$$

اگر نرخ گسیل خود به خودی یا هر سرعت دیگری،‌ بالا باشد، عمر فلورسانس پایین خواهد بود. عمر متوسط ترکیبات فلورسنتی که فوتون‌هایی با انرژی بین مادون قرمز تا فرابنفش تولید می‌کنند، در بازه‌ای بین 0/5 تا 20 نانوثانیه قرار دارد.

شدت فلورسانس

شدت فلورسانس ($$I_f$$)، به مقدار نور جذب شده و بهره کوانتومی فلورسانس طبق رابطه زیر وابسته است:

$$I _ f = k I _ o \phi [ 1 - ( 1 0 ^ { - ε b c } ) ]$$

• $$k$$: ثابت تناسب مربوط به دستگاه
• $$I_o$$: شدت نور تابشی
• $$ε$$: ضریب جذب مولی
• $$b$$: طول مسیر
• $$c$$: غلظت بستر

اگر از محلول‌های رقیق استفاده شود، کمتر از ۲ درصد انرژی برانگیختگی جذب خواهد شد و می‌توان از تخمین زیر استفاده کرد:

$$10^ {x} \approx 1 + x + ...$$

بنابراین، شکل فرمول بالا را می‌توانیم به صورت زیر بنویسیم. این رابطه نشان می‌دهد که شدت فلورسانس وابسته به غلظت است:

 $$I_ f = k I _ o\Phi [εbc]$$

خیلی کم اتفاق می‌افتد که فلورسانس، ناشی از جذب تابش ماورا بنفش با طول موج کوتاه‌تر از 250 نانومتر باشد چراکه این نوع از تابش، انرژی کافی را برای غیرفعال کردن حالت برانگیخته به کمک تفکیک یا «پیش‌تفکیک» (Predissociation) دارد. بیشتر مولکول‌های آلی حداقل پیوندی دارند که با این میزان از انرژی از بین می‌روند. فلورسانس به طور معمول بر اثر گذار از پایین‌ترین سطح ارتعاش اولین حالت برانگیخته به یکی از سطوح انرژی پایه بوجود می‌آید.

اصول طیف سنجی فلورسانس

تصویر زیر، نمایی از یک دستگاه فلوریمتر را نشان می‌دهد که از یک منبع نوری برای برانگیختگی فلورسانس به همراه یک جفت «افزاینده فوتوالکتریک» (Photomultipier Tube) به عنوان مبدل بهره می‌گیرد. منبع نور به دو بخش پرتو مرجع و نمونه تقسیم می‌شود. به کمک یک دیافراگم، شدت پرتو مرجع به گونه‌ای تنظیم می‌شود که با شدت فلورسانس یکی باشد. هر دو پرتو از یک فیلتر عبور می‌کنند و پرتو مرجع به افزاینده فوتوالکتریک تابیده می‌شود.

فیلم آموزش اصول فلوسایتومتری Flow Cytometry و کاربردهای آن در فرادرس

کلیک کنید

پرتو نمونه، به کمک یک جفت لنز بر روی نمونه متمرکز و سبب گسیل فلورسانس می‌شود. تابش‌های گسیل شده از فیلتر دومی عبور می‌کنند و سپس بر روی افزاینده فوتوالکتریک متمرکز می‌شوند. در ادامه، خروجی الکتریکی از دو «مبدل» (Transducer)، توسط یک مبدل آنالوگ به دیجیتال پردازش می‌شود تا نسبت شدت‌های نمونه به مرجع اندازه‌گیری شوند. این پردازش‌ها در آنالیزهای کمی و کیفی کاربرد خواهند داشت. برای این‌که یک طیف گسیلی داشته باشیم از دو «مونوکروماتور» (Monochromator) یا تکفام‌ساز استفاده می‌کنیم. مونوکروماتورهای برانگیختگی و گسیل، به ترتیب ثابت و متغیر هستند. برای طیف برانگیختگی، مونوکروماتور برانگیختگی، متغیر و دیگری ثابت خواهد بود.

فلورسانس و غلظت ترکیبات

از این روش طیف‌سنجی فلورسانس برای اندازه‌گیری غلظت ترکیبات بهره می‌گیرند چراکه شدت فلورسانس به طور خطی با غلظت مولکول فلورسانس مرتبط است. از مولکول‌های فلورسانس به عنوان «برچسب» (Tag) نیز استفاده می‌شود. به طور مثال، «فلورسانس هیبریداسیون درجا» (Fluorescence In Situ Hybridization) روشی برای تعیین نوع ژن‌های حاضر در ژنوم یک موجود زنده است. همچنین، پروتئین فلورسانس سبز (GFP) در زیست‌شناسی مولکولی بمنظور رصد فعالیت‌های پروتئین‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد.

قوانین موجود در فلورسانس

چندین قانون در خصوص فلورسانس وجود دارد که در ادامه به آن‌ها خواهیم پرداخت. در هریک از این قوانین، موارد استثنا هم وجود دارد اما این قوانین، راهنمای مفیدی برای فهم فلورسانس به شمار می‌آیند.

قانون کاشا

«قانون کاشا» (Kasha's Rule) بیان می‌کند که بهره کوانتومی لومینسانس، مستقل از طول موج تابش برانگیختگی است زیرا به طور معمول قبل از اینکه گسیل فلورسانس انجام شود، واپاشی مولکول‌های برانگیخته در پایین‌ترین سطح ارتعاشی حالت برانگیخته اتفاق می‌افتد. قانون کاشا در تمامی موارد صدق نمی‌کند و به شدت در برخی مولکول‌های ساده نقض می‌شود. البته بهتر است این قانون را به شکل بهتری بیان کرد به این صورت که طیف فلورسانس، وابستگی کمی به طول موج تابش برانگیختگی دارد.

قانون تصویر آینه‌ ای

برای بسیاری از فلوروفورها (فلوئورسازه‌ها)، طیف جذبی، تصویر آینه‌ای طیف گسیلی است. این مورد به قانون تصویر آینه‌ای شناخته می‌شود و مرتبط با «اصل فرانک-کاندون» (Frank-Condon Principle) است که بیان می‌کند گذار الکترونی به صورت عمودی است و این تغییرات انرژی بدون تغییر مکان صورت می‌گیرند که می‌توان آن‌ها را به صورت خطی عمودی در دیاگرام جابلونسکی نشان داد. این امر بدان معنی است که هسته، حرکتی نخواهد داشت و سطوح ارتعاشی حالت برانگیخته،‌ مشابه سطوح ارتعاشی حالت پایه هستند.

جابجایی استوکس

به طور کلی، نور گسیل شده فلورسانس، طول موج بلندتر و انرژی کمتری از نور جذب شده دارد. این پدیده که به «جابجایی استوکس» (Stokes Shift) موسوم است، به دلیل هدررفت انرژی در زمان جذب و گسیل فوتون اتفاق می‌افتد. علل و مقدار جابجایی استوکس، موارد پیچیده‌ و وابسته به فلوروفور و محیط آن هستند. به طور معمول، این امر ناشی از واپاشی غیرتابشی به پایین‌ترین سطح انرژی ارتعاشی حالت برانگیخته است. عامل دیگر این است که گسیل فلورسانس در بیشتر موارد، فلوروفوری با سطح ارتعاشی بالاتر به جای می‌گذارد.

فلورسانس در طبیعت

ترکیبات طبیعی بسیاری هستند که خاصیت فلورسانس دارند. بسیاری از جاندارن زیر دریا نیز دارای ساختارهای فلورسانس هستند. در ادامه سعی داریم به برخی از این موارد اشاره کنیم.

بیوفلورسانس

همانطور که در ابتدای متن توضیح داده شد، فلورسانس،‌ به جذب موقتی طول موج‌های الکترومغناطیسی از طیف نور مرئی توسط مولکول‌های فلورسنت و گسیل نور با انرژی کمتر می‌گویند. زمانی که این فرآیند در یک موجود زنده انجام شود، به آن بیوفلورسانس می‌گویند. این امر سبب می‌شود، نور گسیل شده، رنگ متفاوتی از نور تابشی داشته باشد. این نورهای محرک،‌ یک الکترون را برانگیخته می‌کنند و انرژی آن‌را به سطحی ناپایدار می‌رسانند. این ناپایداری،‌ حالتی نامطلوب را ایجاد می‌کند. بنابراین، این الکترون، به سرعت و بعد از برانگیختگی، به حالت پایدار خود باز می‌گردد که این فرآیند با آزاد کردن انرژی اضافی به شکل نور فلورسانس همراه است.

این گسیل نور را تنها زمانی می‌توان مشاهده کرد که نور محرک، همچنان در حال نوردهی با رنگ‌های زرد، صورتی، نارنجی، قرمز، سبز یا بنفش به شی یا موجود زنده باشد. فلورسانس را به طور معمول با بیولومینانس و بیوفسفرسانس اشتباه می‌گیرند. در تصویر زیر، نوعی قورباغه را با خاصیت فلورسانس مشاهده می‌کنید.

فلورسانس در آب

آب، نورهایی با طول موج بلند را جذب می‌کند و درنتیجه، نورهای کمتری از این طیف بازتاب خواهند شد. در اثر این اتفاق، رنگ‌های گرم از طیف مرئی، با اشباع رنگی کمتر، عمق آب را بیشتر نشان می‌دهند. همچنین، آب، طول موج‌های کوتاه‌تر بعد از رنگ بنفش را پراکنده می‌کند. این امر بدان معنی است که رنگ‌های سردتر، بخش عمده لایه بالایی آب را تشکیل می‌دهند. شدت نور در هر 75 متر، ۱۰ برابر کمتر می‌شود یعنی در عمق ۷۵ متری از سطح دریا، شدت نور، تنها ۱۰ درصد شدت آن در سطح است. به همین ترتیب، در عمق 150 متری، شدت نوری برابر با ۱ درصد شدت نور در سطح داریم.

به دلیل این خاصیت فیلتر شدن طول موج و شدت نور عبوری، پروتئین‌های مختلفی بر اساس توانایی جذب نور، در عمق‌های مختلفی از آب حضور دارند. به طور نظری، چشم برخی از ماهی‌ها، نور را تا عمق 1000 متری تشخیص می‌دهند. با توجه به مواردی که گفته شد، در این عمق، تنها منبع نوری، خود موجودات زنده هستند که در اثر واکنش‌های شیمیایی، در فرآیندی موسوم به بیولومینسانس، از خود نور ساطع می‌کنند.

برای انجام هر نوع فلورسانسی به حضور یک منبع خارجی نور نیاز داریم. در بالاترین لایه آبی دریاها موسوم به «ناحیه فوتیک» (Photic Zone)، فلورسانس بیولوژیکی دیده می‌شود. این در حالیست که نور کافی برای فلورسانس وجود ندارد اما این نور برای سایر موجودات زنده قابل تشخیص خواهد بود. گستره بینایی در ناحیه فوتیک به طور معمول، آبی‌رنگ است. بنابراین، رنگ‌های فلورسانس را می‌توان به صورت قرمز روشن، نارنجی، زرد و سبز شناسایی کرد. رنگ سبز، معمول‌ترین رنگی است که دیده می‌شود و بعد از آن‌، رنگ‌های زرد و نارنجی قرار دارند.

ماهی‌ها

ماهی‌های استخوانی که در آب‌های کم‌عمق زندگی می‌کنند، دارای رنگ‌های متنوعی هستند. این ماهی‌ها برای ارتباط با گونه‌های هم‌نوع خود از فلورسانس‌های قرمز، نارنجی و سبز استفاده می‌کنند. بسیاری از ماهی‌ها و کوسه‌هایی که خاصیت فلورسانس دارند، دارای فیلترهای زردرنگی داخل چشم خود هستند. این فیلترها در چشم موجب افزایش کنتراست و دیدن الگوهایی می‌شود که سایر ماهی‌ها و شکارچیانِ فاقد این ویژگی، قابلیت رویت آن‌ها را ندارند. در حقیقت بسیاری از ماهی‌ها، الگوهای ناهماهنگی دارند که موجب استتار آن‌ها می‌شود و این فیلترها قابلیت تشخیص چنین الگوهایی را نیز فراهم می‌کنند.

کاربرد دیگر فلورسانس در آب، تولید رنگ نارنجی و قرمز از نور آبی‌رنگ ناحیه فوتیک، جهت کمک به بینایی موجودات این ناحیه است. نور قرمز به دلیل تضعیف طول موج‌های آن توسط آب، تنها در فاصله‌های کوتاه قابل رویت است. بسیاری از ماهی‌هایی که فلورسانس ایجاد می‌کنند،‌ کوچک هستند و به صورت گروهی زندگی می‌کنند و دارای طرح‌های مشخصی هستند. این طرح‌ها و الگوها بوسیله بافت‌های فلورسانس ایجاد می‌شوند و برای سایر اعضای گروه قابل مشاهده هستند. این خاصیت «درون‌گونه‌ای» (Intraspecific) با سیگنال‌هایی درون‌گونه‌ای همراه می‌شود. چنین الگوهایی داخل چشم قرار دارند و تحقیقات نشان می‌دهند که فلورسانس‌های قرمز‌رنگ در این الگوها جهت ارتباط بین اعضای گروه مورد استفاده قرار می‌گیرند.

کاربردهای فلورسانس

در ادامه به کاربردهای فلورسانس در نورپردازی و شیمی تحلیلی (شیمی تجزیه) خواهیم پرداخت.

فیلم آموزش شیمی تجزیه 1 + نکات کاربردی در فرادرس

کلیک کنید

نورپردازی

از کاربردهای این پدیده می‌توان به لامپ فلورسانس اشاره کرد. در داخل این لامپ، خلا جزئی به همراه مقداری جیوه وجود دارد. تخلیه الکتریکی در داخل لامپ سبب می‌شود اتم‌های جیوه، نور ماورا بنفش گسیل کنند. این لامپ به کمک پوششی از ماده فلورسنت فسفر، اندود شده است که نور ماورا بنفش را جذب و به طور مجدد آن‌را به صورت نور مرئی گسیل می‌کند. این لامپ‌ها نسبت به لامپ‌های فیلامنتی (حبابی)، انرژی کمتری مصرف می‌کنند.

البته لامپ‌های فلورسنت قدیمی، به دلیل طیف رنگی ناهماهنگ، رنگ‌هایی متفاوت از نور روز بدست می‌دهند. طیف گسیلی بخار جیوه در خط ماورا بنفش و 254 نانومتر قرار دارد و بیشترین انرژی را برای فسفر فراهم می‌کند. پرتوهای دیگری نیز در محدوده طیف مرئی شامل رنگ‌های آبی (456 نانومتر)، سبز (546 نانومتر) و زرد-نارنجی (579 نانومتر) همراه با پرتو ماورا بنفش گسیل می‌شوند.

این خطوط مرئی به همراه خطوط گسیلی از عناصر یوروپیوم و تربیم، تابشی غیرپیوسته را بوجود می‌آورند که می‌توان آن‌را در لامپ‌های کم‌مصرف امروزی مشاهده کرد. لامپ‌های فلورسنت در سال 1939 در دسترس عموم قرار گرفت. در ادامه نیز این محصول شاهد پیشرفت‌هایی در عمر بیشتر، نوع فسفر استفاده شده و تخلیه الکتریکی پایدارتر بود. همچنین، این لامپ‌ها با اشکالی کاربردی‌تر به بازار عرضه شدند.

شیمی تجزیه

طول موج‌های مختلف فلورسانس را می‌توان توسط آشکارسازها، شناسایی کرد. از این آشکارسازها در کروماتوگرافی HPLC و کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) بهره می‌گیرند. فلورسانس زمانی بیشترین تاثیر را خواهد داشت که در یک توزیع بولتزمن، نسبت بزرگتری از اتم‌ها با سطوح انرژی پایین‌تر داشته باشیم. در نتیجه، احتمال بیشتری از برانگیختگی و آزاد شدن فوتون توسط اتم‌های با انرژی کم خواهیم داشت که آنالیز را بهبود می‌بخشند.

بیوشیمی و پزشکی

از فلورسانس در علوم زیستی به عنوان روشی غیر مخرب در ردیابی یا آنالیز مولکول‌های بیولوژیکی بهره می‌گیرند. این کار بوسیله گسیل فلورسنت در فرکانسی خاص انجام می‌شود. در حقیقت، همانطور که پیش‌تر نیز اشاره شد، به کمک فلورسانس می‌توان یک پروتئین یا اجزای دیگر را برچسب‌گذاری کرد.

میکروسکوپ فلورسانس

به هنگام بررسی بافت‌ها و ساختارهای سلولی، می‌توان از میکروسکوپ‌های فلورسانس استفاده کرد که از طریق برچسب‌گذاری یک آنتی‌بادی به کمک فلوروفور انجام می‌گیرد. به آنتی‌بادی فرصت داده می‌شود تا آنتی‌ژن هدف را پیدا کند.

نساجی

ترکیبات فلورسنت به طور معمول برای بهبود ظاهر پارچه و کاغذ استفاده می‌شود که اثر براق به آن‌ها می‌دهد. سطحی سفیدرنگ که با یک براق‌کننده نوری فرآوری شده باشد، نور مرئی را بهتر گسیل می‌کند و با این کار آن‌را براق‌تر نشان می‌دهد. از این براق کننده‌های نوری در شوینده‌های لباس، کاغذ، لوازم آرایشی و لباس‌های ایمنی براق استفاده می‌شود.

اگر این مطلب برای شما مفید بوده‌ است،‌ آموزش‌ها و مطالب زیر نیز به شما پیشنهاد می‌شوند:

• مجموعه آموزش‌های دروس شیمی
• مجموعه آموزش‌های نرم‌افزارهای مهندسی شیمی
• آموزش شیمی عمومی
• آلیاژ چیست؟ — به زبان ساده
• کلر و نقش آن در شیمی — از صفر تا صد
• جدول تناوبی — از صفر تا صد

^^