محیط کشت سلولی چیست؟ — انواع و کاربردها به زبان ساده

۲۷۱۶ بازدید
آخرین به‌روزرسانی: ۰۹ اردیبهشت ۱۴۰۲
زمان مطالعه: ۲۷ دقیقه
محیط کشت سلولی چیست؟ — انواع و کاربردها به زبان ساده

کشت سلول یکی از تکنیک‌های اصلی در علوم زیستی است. این اصطلاح عمومی برای حذف سلول‌ها، بافت‌ها یا اندام‌های یک حیوان یا گیاه و قرارگیری بعدی آن‌ها در یک محیط مصنوعی که به بقا یا تکثیر آن‌ها کمک می‌کند، است. الزامات اساسی محیط کشت سلولی برای رشد بهینه سلول‌ها شامل مواردی از قبیل دمای کنترل شده و دستگاه‌هایی مانند انکوباتور هستند که در این مطلب به بررسی انواع محیط کشت سلولی، کاربردهای آن‌ها، الزامات مورد نیاز کشت سلول و آلودگی‌های احتمالی و رفع آن‌ها می‌پردازیم.

فهرست مطالب این نوشته
997696

محیط کشت سلولی چیست؟

محیط کشت سلولی به محیطی گفته می‌شود که در آن سلول‌های گیاهی یا حیوانی مورد نظر در شرایط آزمایشگاهی رشد می‌کنند. کشت سلولی فرایند رشد مصنوعی سلول‌های محیطی است که از ارگانیسم میزبان جدا شده اند. محیط کشت سلولی یا مواد رشد دهنده، مواد مغذی ضروری برای رشد و بقای سلول‌های زنده در محیط انکوباتور هستند. صرف نظر از منشاء، تکثیر موفقیت آمیز این سلول‌ها متکی به استفاده از محیط‌‌های تخصصی است که به دقت برای رشد و نگه‌داری سالم طراحی شده اند.

در آغاز فناوری کشت سلولی، اجزای اصلی محیط‌های کشت سلولی محصولات طبیعی مشتق شده مانند سرم بودند. سپس زمینه به تدریج به استفاده از محیط‌های مصنوعی شیمیایی تغییر کرد، زیرا مواد طبیعی دارای معایب خود هستند.

محیط کشت سلول

انواع محیط کشت سلولی

به طور کلی، سلول‌های کشت شده به محیطی استریل و تامین مواد مغذی برای رشد نیاز دارند. علاوه بر این، محیط کشت سلولی باید از نظر pH و دما پایدار باشد. در 60 سال گذشته، انواع مختلف محیط‌های پایه تعریف شده توسعه یافته اند و اکنون به صورت تجاری در دسترس هستند. در ابتدا، محلول‌های نمکی متعادل برای حفظ انقباض بافت قلب پستانداران و محلول نمک تیرود برای استفاده در سلول‌های اولیه پستانداران طراحی شده بود. این فرمول‌های بنیادی از آن زمان اصلاح شده و با اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها، اسیدهای چرب و لیپیدها غنی شده اند تا محیط کشت مدرن برای حمایت از رشد طیف وسیعی از انواع سلول‌ها مناسب باشد. فرمولاسیون دقیق محیط کشت سلولی اغلب با بهینه سازی غلظت هر ترکیب تشکیل شده است. نمونه‌هایی از محیط‌های مختلف و کاربردهای آن‌ها در زیر آورده شده است:

محیط کشت سلولی طبیعی

محیط‌های طبیعی فقط از مایعات بیولوژیکی طبیعی تشکیل شده اند. محیط‌های کشت سلولی طبیعی برای طیف وسیعی از کشت سلول‌های حیوانی بسیار مفید و مناسب هستند. ضعف عمده محیط‌های طبیعی، تکرارپذیری ضعیف آن به دلیل عدم آگاهی از ترکیب دقیق این محیط‌ها است. انواع موارد استفاده در محیط کشت سلولی طبیعی شامل موارد زیر هستند:

  • مایعات بیولوژیک. پلاسما، سرم، لنف، سرم بند ناف انسان، مایع آمنیوتیک.
  • عصاره‌های بافتی. عصاره کبد، طحال، تومورها، لکوسیت‌ها و مغز استخوان، عصاره جنین گاو و جنین جوجه.
  • کلاته کننده‌ها. منعقد کننده‌ها یا لخته کننده‌های پلاسما.
پلاسما در محیط کشت
پلاسما به صورت تجاری برای تهیه محیط کشت سلولی در دسترس است.

محیط کشت سلولی مصنوعی

محیط‌های کشت سلولی مصنوعی یا سنتزی با افزودن مواد مغذی (اعم از آلی و معدنی)، ویتامین‌ها، نمک‌ها، فازهای گاز O2 و CO2 ، پروتئین‌های سرم، کربوهیدرات‌ها، کوفاکتورها آماده می‌شوند. محیط‌های مصنوعی مختلفی برای خدمت به یک یا چند هدف زیر طراحی شده اند:

  • زنده ماندن فوری (محلول نمک متعادل، با pH خاص و فشار اسمزی)
  • بقای طولانی مدت (محلول نمک متعادل با فرمول‌های مختلف ترکیبات آلی یا سرم)
  • رشد نامحدود
  • عملکردهای تخصصی

محیط‌های کشت سلولی مصنوعی به چهار دسته تقسیم می‌شوند که در ادامه در مورد آن‌ها توضیح داده ایم.

محیط کشت سلولی حاوی سرم

سرم جنین گاوی رایج ترین مکمل در محیط کشت سلولی حیوانی است. به عنوان یک مکمل کم هزینه برای تهیه محیط کشت مطلوب استفاده می‌شود. سرم برای مواد مغذی ناپایدار یا نامحلول در آب، هورمون‌ها و فاکتورهای رشد، مهارکننده‌های پروتئاز، حامل یا کلاتور فراهم می‌کند و قسمت‌های سمی را متصل و خنثی می‌کند.

محیط کشت سلولی فاقد سرم

وجود سرم در محیط‌ها اشکالات زیادی دارد و می‌تواند منجر به سوء تفسیرهای جدی در مطالعات ایمنی شناسی شود. تعدادی محیط کشت بدون سرم تولید شده است، این محیط‌ها عموماً برای حمایت از کشت یک نوع سلول، مانند «جایگزینی سرم حذفی» (Knockout Serum Replacement) و «DMEM حذفی» (Knockout DMEM) از Thermo Fisher Scientific و محیط mTESR از فناوری سلول‌های بنیادی برای سلول‌های بنیادی و شامل مقادیر مشخصی از فاکتورهای رشد تصفیه شده، لیپوپروتئین‌ها و سایر پروتئین‌ها که معمولاً توسط سرم تهیه می‌شوند، فرموله شده اند. از آنجا که اجزای این محیط‌ها شناخته شده هستند، این محیط‌ها به محیط کشت تعریف شده نیز نامیده می‌شود.

محیط کشت فاقد سرم
محیط کشت‌های فاقد سرم در دسترس برای انجام کشت‌های سلولی

محیط کشت سلولی از لحاظ شیمیایی تعریف شده

«محیط‌های شیمیایی تعریف شده» (Chemically defined media) این محیط‌ها حاوی مواد معدنی فوق العاده خالص و بدون آلودگی هستند و همچنین ممکن است حاوی مواد افزودنی پروتئین خالص مانند عوامل رشد باشند. اجزای تشکیل دهنده آن‌ها در باکتری یا مخمر با مهندسی ژنتیک با افزودن ویتامین‌ها، کلسترول، اسیدهای آمینه خاص و اسیدهای چرب تولید می‌شوند.

محیط کشت سلولی بدون پروتئین

محیط‌های بدون پروتئین حاوی هیچ گونه پروتئین نیستند و فقط حاوی اجزای غیر پروتئینی هستند. در مقایسه با محیط‌های مکمل سرم، استفاده از محیط بدون پروتئین باعث رشد سلولی برتر و بیان پروتئین می‌شود و تخلیص پایین دست هر محصول بیان شده را تسهیل می‌کند. فرمولاسیون‌هایی مانند MEM ، RPMI-1640 فاقد پروتئین هستند و در صورت نیاز با مکمل پروتئین تهیه می‌شوند.

ترکیبات محیط کشت سلولی

محیط کشت حاوی ترکیبی از آمینو اسیدها، گلوکز، نمک‌ها، ویتامین‌ها و سایر مواد مغذی است و به صورت پودر یا به صورت مایع از تأمین کنندگان تجاری موجود است. الزامات این اجزا در بین رده‌های سلولی متفاوت است و این تفاوت‌ها تا حدی مسئول تعداد زیادی از فرمول‌های متوسط ​​است. هر جزء از محیط کشت سلولی عملکرد خاصی را انجام می‌دهد، که در ادامه در مورد هر کدام بیشتر توضیح داده ایم.

سیستم های بافری

تنظیم pH برای شرایط مطلوب کشت بسیار مهم است و به طور کلی توسط یکی از دو سیستم بافری زیر به دست می‌آید:

  • سیستم بافری طبیعی. در یک سیستم بافر طبیعی، CO2 گازی با محتوای CO3/HCO3 محیط کشت متعادل می‌شود. کشت‌هایی که دارای سیستم بافری طبیعی هستند باید در جو با 5 تا 10 درصد CO2، معمولاً توسط دستگاه انکوباتور CO2 نگه‌داری شوند. یک سیستم بافر طبیعی کم هزینه و غیر سمی است.
  • HEPES. بافر شیمیایی با استفاده از «زویتریون» (zwitterion)، HEPES، دارای ظرفیت بافر برتر در محدوده pH از ۷/۲ تا 7/4 است و نیازی به اتمسفر گازی کنترل شده ندارد. HEPES در غلظت بالاتری برای برخی از انواع سلول‌ها نسبتاً گران و سمی است. HEPES همچنین نشان داده است که حساسیت محیط‌ها را نسبت به اثرات فوتوتوکسیک ناشی از قرار گرفتن در معرض نور فلورسنت بسیار افزایش می‌دهد.
بافر محیط کشت سلولی

فنول رد

اکثر محیط‌های کشت تجاری موجود در بازار شامل فنول قرمز به عنوان شاخص pH است که امکان نظارت مداوم بر pH را فراهم می‌کند. در طول رشد سلول، محیط با تغییر pH به دلیل متابولیت‌های آزاد شده توسط سلول‌ها تغییر رنگ می‌دهد. در سطوح pH پایین، فنل قرمز رنگ متوسط ​​را زرد می‌کند، در حالی که در سطوح pH بالاتر آن را به رنگ بنفش متوسط ​​در می‌آورد. رنگ قرمز برای PH = 7/4 قرمز روشن است، این مقدار pH مطلوب برای کشت سلولی است. با این حال، استفاده از فنل قرمز معایب خاصی دارد که در زیر توضیح داده شده است:

  • فنل قرمز عملکرد برخی از هورمون‌های استروئیدی، به ویژه استروژن را تقلید می‌کند.
  • وجود فنل قرمز در برخی از فرمول‌های بدون سرم با هموستاز سدیم - پتاسیم تداخل دارد. این اثر را می‌توان با گنجاندن سرم یا هورمون هیپوفیز گاوی در محیط خنثی کرد. فنل قرمز در مطالعات فلوسایتومتری با تشخیص تداخل دارد.

نمک معدنی

نمک معدنی موجود در محیط به حفظ تعادل اسمزی و تنظیم پتانسیل غشاء با تامین یون‌های سدیم، پتاسیم و کلسیم کمک می‌کند.

آمینو اسیدها

اسیدهای آمینه بلوک‌های سازنده پروتئین‌ها بوده و بنابراین اجزای ضروری همه محیط‌های شناخته شده کشت سلولی هستند. اسیدهای آمینه ضروری باید در محیط کشت گنجانده شوند، زیرا سلول‌‌ها نمی‌توانند این‌ها را به تنهایی سنتز کنند. این ترکیبات برای تکثیر سلول‌ها مورد نیاز هستند و غلظت آن‌ها حداکثر تراکم سلولی قابل دستیابی را تعیین می‌کند. L-glutamine، یک اسید آمینه ضروری است که از اهمیت ویژه ای برخوردار است. ال - گلوتامین نیتروژن را برای NAD ، NADPH و نوکلئوتیدها فراهم می‌کند و به عنوان منبع انرژی ثانویه برای متابولیسم عمل می‌کند.

ال - گلوتامین یک آمینو اسید ناپایدار است که با گذشت زمان به شکلی تبدیل می‌شود که سلول‌ها نمی‌توانند از آن استفاده کنند و بنابراین باید قبل از استفاده به محیط افزوده شود. هنگام افزودن L - گلوتامین بیشتر از آنچه در فرمولاسیون محیط اصلی توصیه می‌شود، باید احتیاط کرد زیرا تجزیه آن منجر به تجمع آمونیاک می‌شود و آمونیاک می‌تواند بر برخی از رده‌های سلولی تأثیر مخرب داشته باشد.

آمینواسیدها در محیط کشت سلول
وجود آمینواسیدهایی مانند L-گلوتامین برای کشت سلول‌ها در محیط ضروری است.

غلظت L - گلوتامین برای محیط کشت سلولی پستانداران می‌تواند از 0/68 میلی مولار در متوسط ​​199 تا 4 میلی مولار در محیط Dulbecco’s Modified Eagles’s متغیر باشد. محیط کشت سلولی بی‌مهرگان می‌تواند تا 12/3 میلی مولار L - گلوتامین داشته باشد. مکمل‌هایی مانند گلوتاماکس پایدارتر هستند و می‌توانند جایگزین گلوتامین برای کشت طولانی مدت سلول‌های کند شوند. تامین کنندگان معمولی L- glutamine برای کشت سلولی MilliporeSigma (G7513) است. اسیدهای آمینه غیر ضروری نیز ممکن است به محیط اضافه شوند تا جایگزین اسیدهای آمینه‌ای شوند که در طول رشد تخلیه شده اند. مکمل محیط با اسیدهای آمینه غیر ضروری باعث تحریک رشد و افزایش طول عمر سلول‌ها می‌شود.

کربوهیدرات ها

کربوهیدرات‌ها به شکل قندها منبع اصلی انرژی هستند. اکثر محیط‌های کشت حاوی گلوکز و گالاکتوز هستند، با این حال، برخی از آن‌ها حاوی مالتوز و فروکتوز هستند.

پروتئین ها و پپتیدها

پرکاربردترین پروتئین‌ها و پپتیدها در محیط کشت سلولی آلبومین، ترانسفرین و فیبرونکتین هستند. آن‌ها به ویژه در محیط‌های بدون سرم اهمیت دارند. سرم منبع غنی پروتئین است و شامل آلبومین، ترانسفرین، آپروتینین، فتوئین و فیبرونکتین است. آلبومین پروتئین اصلی در خون است که به آب، نمک‌ها، اسیدهای چرب آزاد، هورمون‌ها و ویتامین‌ها متصل شده و آن‌ها را بین بافت‌ها و سلول‌ها منتقل می‌کند. ظرفیت اتصال آلبومین باعث می‌شود که مواد سمی مناسب از محیط کشت سلولی حذف شوند. آپروتینین یک عامل محافظ در سیستم‌های کشت سلولی است، در pH خنثی و اسیدی پایدار است و در برابر درجه حرارت بالا و تخریب توسط آنزیم‌های پروتئولیتیک مقاوم است.

این ماده می‌تواند چندین پروتئاز سرین مانند تریپسین را مهار کند. فتوئین یک گلیکوپروتئین است که در سرم جنین و نوزادان در غلظت‌های بیشتر از سرم بزرگسالان یافت می‌شود. این ماده همچنین مهار کننده پروتئین‌های سرین است. فیبرونکتین یک عامل کلیدی در چسبندگی سلول محسوب می‌شود. ترانسفرین یک پروتئین انتقال دهنده آهن است که برای تأمین آهن غشای سلولی عمل می‌کند.

پروتئین در محیط کشت

اسیدهای چرب و لیپیدها

این مواد به ویژه در محیط‌های کشت سلولی بدون سرم بسیار مهم هستند زیرا عموماً در سرم و محیط‌های حاوی سرم وجود دارند.

ویتامین ها

بسیاری از ویتامین‌ها برای رشد و تکثیر سلول‌ها ضروری هستند. ویتامین‌ها نمی‌توانند به میزان کافی توسط سلول‌ها سنتز شوند و بنابراین مکمل‌های مهمی هستند که در کشت سلول و بافت مورد نیاز هستند. دوباره سرم منبع اصلی ویتامین‌ها در کشت سلولی است، با این حال، محیط‌ها نیز غنی از ویتامین‌های مختلف هستند و آن‌ها را برای یک رده سلولی خاص مناسب می‌کنند. ویتامین‌های گروه B بیشتر برای تحریک رشد اضافه می‌شوند.

عناصر کمیاب

عناصر کمیاب اغلب به محیط‌های بدون سرم اضافه می‌شوند تا جایگزین آن‌هایی شوند که به طور معمول در سرم یافت می‌شوند. عناصر کمیاب مانند مس، روی، سلنیوم و تری کربوکسیلیک اسید عناصر شیمیایی هستند که برای رشد مناسب سلول‌ها به مقدار کمی مورد نیاز است. این ریز مغذی‌ها برای بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی، به عنوان مثال، حفظ عملکرد آنزیم‌ها ضروری هستند.

مکمل های محیط کشت سلولی

محیط رشد کامل توصیه شده برای رده‌های سلولی خاص نیاز به اجزای اضافی دارد که در محیط پایه و سرم وجود ندارد. این اجزا، مکمل‌ها، به تکثیر و حفظ متابولیسم طبیعی سلول‌ها کمک می‌کند. اگرچه مکمل‌هایی مانند هورمون‌ها، عوامل رشد و مواد علامت دهنده برای رشد طبیعی برخی از رده‌های سلولی مورد نیاز است، اما همیشه بهتر است اقدامات احتیاطی زیر را انجام دهید:

  • از آنجا که افزودن مکمل می‌تواند اسمولالیته محیط رشد کامل را تغییر دهد که ممکن است بر رشد سلول‌ها تأثیر منفی بگذارد، همیشه بهتر است بعد از افزودن مکمل‌ها، اسمولالیته را مجدداً بررسی کرد.
  • برای اکثر رده‌های سلولی، اسمولالیته مطلوب باید بین 260 mOSM/kg و 320 mOSM/kg باشد.
  • ماندگاری محیط رشد پس از افزودن مکمل‌ها تغییر می‌کند. محیط‌های کامل حاوی مکمل پروتئین تمایل دارند سریع‌تر از محیط پایه به تنهایی تجزیه شوند.
مکمل های کشت سلول

آنتی بیوتیک ها در محیط کشت سلولی چه نقشی دارند؟

اگرچه برای رشد سلولی لازم نیست، آنتی بیوتیک‌ها اغلب برای کنترل رشد آلودگی‌های باکتریایی و قارچی استفاده می‌شوند. استفاده معمول از آنتی بیوتیک‌ها برای کشت سلولی توصیه نمی‌شود زیرا آنتی بیوتیک‌ها می‌توانند آلودگی مایکوپلاسما و باکتری‌های مقاوم را پنهان کنند. علاوه بر این، آنتی بیوتیک‌ها همچنین می‌توانند متابولیسم سلول‌های حساس را مختل کنند. آماده سازی پنی سیلین - استرپتومایسین از Life Technologies (15140163) و MilliporeSigma (P0781) انتخاب‌های معمولی هستند. پلاسموسین می‌تواند آلودگی مایکوپلاسما را از بین ببرد و در کشت رده‌های سلولی گلیوما TS603 ، TS516 و BT260 استفاده شده است. علاوه بر این، کشت سلولی اولیه نیز می‌تواند توسط قارچ‌ها، تک یاخته‌ها و سلول‌های گیاهی (برای کشت سلول‌های حیوانی)، به دلیل میزبان یا شرایط دیگر، آلوده شود.

سرم در محیط کشت سلولی

سرم ترکیبی پیچیده از آلبومین‌ها، عوامل رشد و بازدارنده‌های رشد است. سرم یکی از مهم‌ترین اجزای محیط کشت سلولی است و به عنوان منبع اسیدهای آمینه، پروتئین‌ها، ویتامین‌ها (به ویژه ویتامین‌های محلول در چربی مانند A ، D ، E و K) کربوهیدرات‌ها، لیپیدها، هورمون‌ها، عوامل رشد، مواد معدنی و عناصر کمیاب عمل می‌کند. سرم از منابع گاوی و گوساله معمولاً برای حمایت از رشد سلول‌ها در کشت استفاده می‌شود. سرم جنین منبع غنی از فاکتورهای رشد است و برای شبیه سازی سلولی و رشد سلول‌های سخت‌گیر مناسب است.

سرم گوساله به دلیل خواص تحریک کننده رشد کمتر در «مطالعات مهار تماس» (Contact - Inhibition studies) استفاده می‌شود. محیط رشد طبیعی معمولاً حاوی 2 تا 10 درصد سرم است. مکمل محیط با سرم عملکردهای زیر را انجام می‌دهد. سرم مواد مغذی اساسی (هم در محلول و هم به پروتئین‌ها) را برای سلول‌ها فراهم می‌کند. سرم چندین فاکتور رشد و هورمون را در ارتقاء رشد و عملکرد تخصصی سلول‌ها دخیل می‌کند. موارد موجود در سرم را در ادامه بیشتر بررسی کرده ایم.

  • چندین پروتئین اتصال دهنده مانند آلبومین، ترانسفرین را فراهم می‌کند که می‌تواند مولکول‌های دیگر را به داخل سلول منتقل کند. به عنوان مثال: آلبومین چربی‌ها، ویتامین‌ها، هورمون‌ها و غیره را به داخل سلول‌ها منتقل می‌کند.
  • همچنین پروتئین‌هایی مانند فیبرونکتین را تامین می‌کند که باعث اتصال سلول‌ها به بستر می‌شود. همچنین عوامل پخش کننده‌ای را ارائه می‌دهد که به سلول‌ها کمک می‌کند تا قبل از شروع به تقسیم شدن گسترش یابند.
  • این ماده مهار کننده‌های پروتئاز را فراهم می‌کند که سلول‌ها را از پروتئولیز محافظت می‌کند. همچنین مواد معدنی مانند +Na+، K+، Zn2+، Fe2 و غیره را تأمین می‌کند.
  • ویسکوزیته محیط را افزایش می‌دهد و بنابراین، سلول‌ها را از آسیب مکانیکی در حین تکان خوردن کشت‌های سوسپانسیون محافظت می‌کند.
  • سرم همچنین به عنوان یک بافر عمل می‌کند.

با توجه به وجود عوامل رشد و بازدارنده‌ها، نقش سرم در کشت سلولی بسیار پیچیده است. متأسفانه، علاوه بر عملکردهای مختلف، استفاده از سرم در برنامه‌های کشت بافت دارای معایب متعددی است. جدول زیر مزایا و معایب استفاده از سرم در محیط را نشان می‌دهد.

مزایای استفاده از سرم در محیط کشت سلولیمعایب استفاده از سرم در محیط کشت سلولی
سرم حاوی فاکتورهای رشد و هورمون‌های مختلف است که باعث تحریک رشد و عملکرد سلول‌ها می‌شود.عدم یکنواختی در ترکیب سرم
به چسبندگی سلول‌ها کمک می‌کند.برای حفظ کیفیت هر دسته قبل از استفاده، باید آزمایش انجام شود.
به عنوان عامل گسترش دهنده عمل می‌کند.ممکن است حاوی برخی از عوامل بازدارنده رشد باشد.
به عنوان یک عامل بافر عمل می‌کند که به حفظ pH محیط کشت کمک می‌کند.افزایش خطر آلودگی
به عنوان یک پروتئین اتصال دهنده عمل می‌کند.وجود سرم در محیط ممکن است در تصفیه و جداسازی محصولات کشت سلولی اختلال ایجاد کند.
آسیب‌های مکانیکی یا آسیب‌های ناشی از ویسکوزیته را به حداقل می‌رساند.

سایر مواد

برای کشت سوسپانسیون، Pluronic F-68 را با 0/1 درصد می‌توان به منظور کاهش نیروی برشی آب و کاهش کف سازی اضافه کرد.

تهیه محیط کشت سلولی چگونه است؟

محیط کشت سلولی به ۳ شکل از تامین کنندگان تجاری موجود است. فرم پودری که باید توسط محقق تهیه و استریل شود، فرم غلیظ که باید توسط محقق رقیق شود و محلول آماده به کار برای استفاده مستقیم و بدون دستکاری بیشتر کاربرد دارد. پودر کم‌ترین هزینه را دارد اما باید استریل شود. توصیه می‌شود قبل از افزودن سرم آن را با فیلتر استریل کنید زیرا کف ایجاد می‌شود که در حضور سرم پروتئین را از بین می‌برد.

پس از فیلتراسیون می‌توان سرم‌های جنین گاوی یا اسبی را اضافه کرد. محیط‌ها باید همیشه با قرار دادن آن‌ها در دستگاه انکوباتور 37 درجه سانتی گراد به مدت 72 ساعت قبل از استفاده برای اطمینان از استریل بودن مورد آزمایش قرار گیرند تا از عدم آلودگی آن‌ها اطمینان حاصل شود. محیط باید در دمای 4 درجه سانتی گراد نگه‌داری شود. از آنجا که چندین جزء از محیط به نور حساس هستند، محیط‌ها باید در تاریکی ذخیره شوند.

انتخاب محیط کشت سلولی مناسب

انتخاب محیط کشت سلولی بسیار مهم است و بر موفقیت آزمایش‌های کشت سلولی تأثیر بسزایی دارد. انتخاب محیط بستگی به نوع سلول‌های مورد کشت و همچنین هدف کشت و منابع موجود در آزمایشگاه دارد. انواع مختلف سلول‌ها نیازهای رشد بسیار ویژه ای دارند، بنابراین مناسب‌ترین محیط برای هر نوع سلول باید به صورت آزمایشی تعیین شود. به طور کلی، شروع کار با MEM برای سلول‌های چسبنده و RPMI - 1640 برای سلول‌های سوسپانسیون همیشه خوب است. جدول زیر خطوط سلولی متداول مورد مطالعه و محیط رشد توصیه شده را شرح می‌دهد.

رده سلولیمورفولوژیگونه‌هامحیط کشتکاربردها
HeLa BاپیتلیالانسانMEM+ 2mM Glutamine + 10% FBS + 1% Non Essential Amino Acids (NEAA)توموروژنیک بودن و مطالعات ویروسی
HL60لنفوبلاستانسانRPMI 1640 + 2mM Glutamine + 10-20% FBSمطالعات تمایز سلولی
3T3 clone A31فیبروبلاستموشDMEM + 2mM Glutamine + 5% New Born Calf Serum (NBCS) + 5% FBSتوموروژنیک بودن و مطالعات ویروسی
COS-7فیبروبلاستمیمونDMEM + 2mM Glutamine + 10% FBSمطالعات بیان ژن و تکثیر ویروس
CHOاپیتلیالهمسترHam′s F12 + 2mM Glutamine + 10% FBSمطالعات تغذیه‌ای و بیان ژن
HEK 293اپیتلیالانسانEMEM (EBSS) + 2mM Glutamine + 1% Non Essential Amino Acids (NEAA) + 10% FBSمطالعات ترانسفورماسیون
HUVECاندوتلیالانسانF-12 K + 10% FBS + 100 µg/ml Heparinمطالعات آنژیوژنز (رگ زایی)
JurkatلنفوبلاستانسانRPMI - 1640 + 10% FBSمطالعات سیگنالینگ

کشت سلولی اولیه

کشت سلولی اولیه داده‌های تحقیقاتی منحصر به فرد و ارزشمندی را ارائه می‌دهد، اما بیشتر اوقات تعداد سلول‌ها دارای محدودیت است. برای چنین نمونه‌های حیاتی، به ویژه از نمونه برداری‌های انسانی بیمار، یک محیط با کیفیت مورد نیاز است. اکثر شرکت‌های علوم زیستی محیطی کامل و آماده برای استفاده و مکمل ارائه می‌دهند. این امر با حذف مراحل آماده سازی و مکمل مورد نیاز، خطر آلودگی را کاهش می‌دهد و همچنین در زمان، نیروی کار و پول صرفه جویی می‌کند. علاوه بر این، همه این محیط‌ها تحت آزمایشات جامع کنترل کیفیت قرار می‌گیرند و هر قسمت به طور معمول برای ارتقاء رشد، عدم وجود سمیت سلولی و پارامترهای فیزیکی مانند اسمولالیته و سطح pH مورد آزمایش قرار می‌گیرد. جدول زیر محیط‌های توصیه شده ارائه شده توسط شرکت‌های مختلف برای سلول‌های اولیه معمولی را توضیح می‌دهد.

سلول‌هامحیط کشت سلولی
سلول‌های اندوتلیالHuman Endothelial-SFM (Life Technologies), Endothelial Basal Media, EndoGRO-LS Complete Media Kit (MilliporeSigma), HUVEC Basal Medium CB HUVEC (AllCells), Endothelial Cell Medium (ScienCell)
سلول‌های مغز استخوانMarrowMAX Bone Marrow Medium (Life Technologies), Bone Marrow Medium Plus (MilliporeSigma)
سلول‌های گلیالScienCell Astrocyte Medium , GIBCO® Astrocyte Medium
سلول‌های اپیتلیالEpithelial cell medium (ScienCell), EpiGRO primary epithelial cells (MilliporeSigma)
سلول‌های THuman StemXVivo Serum-Free T cell Base Media (R&D Systems), Stemline T cell Expansion Medium (MilliporeSigma)
سلول‌های بنیادی خون سازStemPro-34 SFM (Life Technologies), MethoCult (STEMCELL Technologies, Inc)

انواع محیط کشت های سلولی رایج

محیط‌های کشت سلولی که بیشترین استفاده را در تکنیک کشت سلول دارند در ادامه توضیح داده شده اند.

محیط کشت سلولی DMEM چیست؟

در محیط کشت سلولی DMEM یا (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) غلظت DMEM تقریباً دو برابر آمینو اسیدها و چهار برابر میزان ویتامین‌ها به عنوان EMEM و همچنین نیترات فریک، پیروات سدیم و برخی اسیدهای آمینه مکمل است. فرمول اصلی حاوی 1000 میلی گرم در لیتر گلوکز بود و ابتدا برای کشت سلول‌های موش جنینی گزارش شد.

ثابت شده است که تنوع بیشتر با 4500 میلی گرم در لیتر گلوکز برای کشت انواع مختلف سلول‌ها مطلوب است. DMEM یک محیط پایه است و حاوی پروتئین یا عوامل محرک رشد نیست. بنابراین، نیاز به مکمل دارد تا یک محیط کامل باشد. این ماده معمولاً با 5 تا 10 درصد سرم جنینی (FBS) تکمیل می‌شود. DMEM از سیستم بافر بی کربنات سدیم (3/7 گرم در لیتر) استفاده می‌کند و بنابراین برای حفظ pH مورد نیاز به سطوح مصنوعی CO2 نیاز دارد.

محیط DMEM
محیط‌های کشت DMEM به صورت تجاری قابل تهیه هستند.

محیط پودری بدون بی‌کربنات سدیم فرموله شده است زیرا در حالت پودر تمایل به گاز شدن دارد. محیط پودری پس از حل شدن آن در آب به افزودن 3/7 گرم در لیتر بی‌کربنات سدیم نیاز دارد. DMEM در ابتدا برای کشت سلول‌های بنیادی جنینی موش استفاده شد. مشخص شده است که به طور گسترده‌ای در سلول‌های اولیه موش و مرغ، تشکیل پلاک ویروسی و مطالعات مهار تماس کاربرد دارد. همچنین می‌توان از آن برای کشت هیبریدوما استفاده کرد.

محیط RPMI-1640

RPMI -1640 یک محیط عمومی با طیف گسترده‌ای از برنامه‌های کاربردی برای سلول‌های پستانداران، به ویژه سلول‌های خون‌ساز است. RPMI-1640 در موسسه یادبود پارک رزول (RPMI) در بوفالو، نیویورک توسعه یافت. RPMI-1640 اصلاح شده محیط McCoy's 5A است و برای کشت طولانی مدت لنفوسیت‌های خون محیطی توسعه یافته است. RPMI-1640 از یک سیستم بافر بی‌کربنات استفاده می‌کند و با بیش‌ترین محیط کشت سلولی پستانداران در فرمولاسیون معمولی pH = 8 متفاوت است.

RPMI-1640 از رشد طیف وسیعی از سلول‌ها در حالت تعلیق و تک لایه پشتیبانی می‌کند. اگر RPMI-1640 به طور مناسب با سرم یا جایگزینی مناسب سرم تکمیل شود، طیف وسیعی از کاربردها را برای سلول‌های پستانداران، شامل کشت لنفوسیت‌های تازه انسان، پروتکل‌های همجوشی و رشد سلول‌های هیبریدی مانند سلول‌های هیبریدومای موش برای آماده سازی آنتی بادی دارد. همچنین اغلب برای حفظ یا سوسپانسیون کردن سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی استفاده می‌شود.

محیط RPMI-1640

محیط کشت سلولی EMEM

EMEM یا (Eagle’s Minimum Essential Medium) یکی از اولین محیط‌های پرکاربرد بود و توسط هری ایگل از محیط پایه ساده‌تر (BME) فرموله شد. EMEM حاوی محلول نمک متعادل، اسیدهای آمینه غیر ضروری و پیروات سدیم است. با غلظت بی کربنات سدیم (1500 میلی گرم در لیتر) برای استفاده با 5 درصد CO2 فرموله شده است. از آنجا که EMEM یک محیط غیر پیچیده است، به طور کلی با مکمل‌های اضافی یا سطوح بالاتر سرم غنی شده و آن را برای طیف وسیعی از سلول‌های پستانداران مناسب می‌کند.

Ham’s nutrient mixtures

این محیط‌ها در ابتدا برای حمایت از رشد کلونی سلول‌های تخمدان همستر چینی (CHO) توسعه داده شدند. تغییرات زیادی در فرمولاسیون اصلی از جمله محیط F-12 Hams انجام شده است، فرمولاسیون پیچیده تری نسبت به F-10 اصلی مناسب برای انتشار بدون سرم دارد. بسته به نوع سلول‌های کشت داده شده، مخلوط‌ها برای استفاده با یا بدون مکمل سرم فرموله شدند. انواع این محیط را در ادامه بررسی کرده ایم.

  • Ham's F-10. نشان داده شده است که از رشد سلول‌های دیپلوئید انسان، به عنوان مثال، سلول‌های فیبروبلاست انسان و گلبول‌های سفید خون برای تجزیه و تحلیل کروموزومی پشتیبانی می‌کند.
  • Ham's F-12. نشان داده شده است که از رشد سلول‌های کبدی اولیه موش صحرایی و سلول‌های اپیتلیال پروستات موش پشتیبانی می‌کند. Ham's F-12 با 25 میلی مولار HEPES بافر بهینه‌تر را فراهم می‌کند.
  • تغییر Coon در F-12 Ham. این محیط از تقریباً دو برابر اسیدهای آمینه و پیروات در مقایسه با F-12 تشکیل شده است و همچنین شامل اسید اسکوربیک است. این برای کشت سلول‌های ترکیبی تولید شده توسط همجوشی ویروسی توسعه یافته است.
  • DMEM/F12. این مخلوط از DMEM و Ham's F-12 است و یک محیط فوق العاده غنی و پیچیده است. از رشد طیف وسیعی از انواع سلول‌ها در فرمول‌های با سرم و بدون سرم پشتیبانی می‌کند. بافر HEPES در غلظت نهایی 15 میلی مولار در فرمول گنجانده شده است تا از بین رفتن ظرفیت بافر ناشی از حذف سرم را جبران کند.
Ham’s nutrient mixtures
محیط کشت سلولی Ham's F-12 برای رشد سلول‌های کبدی اولیه موش صحرایی و سلول‌های اپیتلیال پروستات موش مناسب است.

محیط کشت سلولی IMDM

IMDM یا (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium) یک محیط مصنوعی بسیار غنی شده است که برای تکثیر سریع سلول‌های با چگالی بالا مناسب است. IMDM اصلاح DMEM حاوی سلنیوم است و در مقایسه با DMEM دارای اسیدهای آمینه اضافی، ویتامین‌ها و نمک‌های غیر آلی است. به جای نیترات فریک دارای نیترات پتاسیم است و همچنین حاوی HEPES و پیروات سدیم است. این محیط برای رشد لنفوسیت‌ها، به عنوان مثال تمایز مونوسیت‌ها به ماکروفاژها و هیبریدوما فرموله شد. مطالعات نشان داده است که IMDM می‌تواند از لنفوسیت‌های موشی B، بافت خون ساز مغز استخوان، سلول‌های B تحریک شده با لیپو پلی ساکارید، لنفوسیت‌های T، سلول‌های ترکیبی و سایر موارد پشتیبانی کند.

سلول‌های HAP1 از Horizon Discovery، یک رده سلولی مشتق از سلول‌های KBM7 «سرطان خون میلوئیدی مزمن نزدیک هاپلوئید» (Near-Haploid Chronic Myeloid Leukaemia) و خطوط سلولی حذف شده به شکل HAP1 معمولاً در محیط IMDM نگه‌داری می‌شوند. در جدول زیر سلول‌ها یا رده‌های سلولی مختلف را که می‌توان با استفاده از محیط‌های فوق کشت کرد شرح داده شده اند.

محیط کشت سلولیبافت یا رده سلولی قابل کشت در آن
MEMفیبروبلاست جنین جوجه، سلول‌های CHO، سلول‌های عصبی جنینی، سلول‌های نوع آلوئولی، اندوتلیوم، اپیدرم، فیبروبلاست، گلیا، گلیوما، تومورهای انسانی، ملانوم
DMEMاندوتلیوم، سلول‌های اپیتلیال آلوئولار جنین نوع II، اپیتلیوم دهانه رحم، سلول‌های دستگاه گوارش، نوروبلاستومای موش، سلول‌های خوک از غدد تیروئید، سلول‌های سرطان تخمدان، سلول‌های ماهیچه‌ای اسکلتی، سلول‌های سرتولی، فیبروبلاست همستر سوری
RPMI-1640سلول‌های T و تیموسیت‌ها، سلول‌های بنیادی خون ساز، تومورهای انسانی، سلول‌های سرطان خون میلوئید انسانی، خطوط سلولی لنفوبلاستوئید انسانی، میلوم موش، سرطان خون موش، اریترولوسمی موش، هیبریدوم موش، سلول‌های کبد موش
Nutrient mixture F-10 and F-12شبکیه رنگدانه‌دار جنین جوجه، استخوان، غضروف، بافت چربی، سلول‌های ریه جنینی، سلول‌های ماهیچه اسکلتی
IMDMمغز استخوان، سلول‌های پیش ساز خون ساز، رده‌های سلولی لوسمی لنفوبلاستوئید انسانی

بهینه سازی محیط کشت سلولی

پیچیدگی ترکیب محیط کشت سلولی چالش‌های زیادی را برای بهینه سازی اجزای فردی محیط ایجاد می‌کند. اکثر محیط‌های کشت کلاسیک برای کشت‌های با چگالی کم در مقیاس کوچک طراحی شده اند و اغلب به سرم به عنوان یک ماده مغذی کلیدی نیاز دارند. با این حال، در صنعت بیوتکنولوژی که نیاز به تراکم سلولی بالا و افزایش بهره وری سلولی وجود دارد، توسعه و بهینه سازی محیط کشت بسیار مهم است. به طور معمول، محیط‌های صنعت بیوتکنولوژی فاقد سرم بوده و غلظت مواد مغذی بسیار بالاتری نسبت به محیط‌های کلاسیک دارند. برای بهینه سازی محیط‌ها باید پارامترهای زیر در نظر گرفته شود:

بهینه سازی بر اساس محصول مورد نظر تولید

نوع محصول مورد نیاز، استراتژی بهینه سازی محیط ​​را تعیین می‌کند. برای تولید سریع تعداد سلول‌ها، میزان رشد و زنده ماندن سلول‌ها بسیار مهم است. بنابراین، محیط کشت سلولی باید از حداکثر رشد سلولی حمایت کرده و در افزایش تراکم سلولی، ماندگاری سلول را حفظ کند. برای تولید ویروس، فقط تراکم سلولی زیاد لازم نیست بلکه باید مواد مغذی فراوانی در محیط وجود داشته باشد تا تکثیر ویروس پس از عفونت حفظ شود، به عنوان مثال، DMEM High Glucose H-21 برای سلول‌های Lenti-X 293T. برای تولید پروتئین نوترکیب، تراکم سلولی بالا مورد نیاز است. با این حال، مواد مغذی مورد نیاز برای رشد سلول می‌تواند با مواد مورد نیاز برای تولید پروتئین رقابت کند. بنابراین، بسیار مهم است که حداکثر تراکم سلولی را که یک محیط معین می‌تواند برای سطح مورد نیاز بهره وری حفظ کند، به دقت تعیین کند. علاوه بر این، بسیار مهم است که در نظر بگیریم که تغییرات در محیط حین بهینه سازی نباید بر کیفیت محصول تأثیر بگذارد.

محیط کشت سلولی با گلوکز
از محیط کشت سلولی DMEM High Glucose برای کشت سلول‌های Lenti-X 293T استفاده می‌شود.

بهینه سازی بر اساس خطوط سلولی مورد استفاده

رده‌های سلولی مختلف به دلیل تفاوت در متابولیسم که روش‌های بهینه سازی محیط را تعیین می‌کند، نیازهای تغذیه‌ای متفاوتی دارند. رایج ترین رده‌های سلولی مورد استفاده در صنایع بیوتکنولوژی سلول‌های CHO ، BHK-21، سلول‌های هیبریدوما، سلول‌های میلوم و فیبروبلاست‌های دیپلوئید معمولی هستند. برخی از رده‌های سلولی نیازهای تغذیه‌ای خاصی دارند، مانند کلسترول برای سلول‌های میلوم NS0. فیبروبلاست‌های دیپلوئید معمولی به عوامل چسبندگی نیاز دارند تا برای رشد روی سطح چسبیده و پخش شوند. آن‌ها چگالی بسیار کمتری دارند و بنابراین نیازی به مواد مغذی در مقادیر زیاد ندارند. رده‌های سلولی هیبریدوما به طور کلی وابستگی زیادی به گلوتامین دارند. آن‌ها معمولاً فاز ساکن را پس از رسیدن به حداکثر چگالی سلولی ندارند و سپس به سرعت از بین می‌روند. بنابراین، بهینه سازی محیط، کاهش زنده ماندن را کم کرده و تولید آنتی بادی مونوکلونال را بهبود می‌بخشد.

بهینه سازی بر اساس فرآیند تولید

حالت فرآیند تولید نه تنها بر انتخاب محیط کشت سلولی تأثیر می‌گذارد، بلکه رویکردهای بهینه سازی را نیز تحت تأثیر قرار می‌دهد. فرایندهای مختلف تولید مورد استفاده عبارتند از:

  • «کشت بچ» (Batch Process). برای حفظ رشد و بهره وری سلول از یک محیط واحد استفاده می‌شود. بنابراین محیط باید غنی از مواد مغذی باشد اما در محدوده فیزیولوژیکی سلول‌ها باقی بماند.
  • «کشت فد - بچ» (Fed-batch Process). بسته به مرحله فرآیند، چندین نوع محیط در طول دوره کشت سلولی استفاده می‌شوند. یک محیط رشد به گونه‌ای طراحی شده است که غلظت مواد مغذی کمتری در زمانی که تراکم سلولی در حین تلقیح کم است اما سرعت بالای رشد سلول را در مقیاس رشد و تولید اولیه حفظ می‌کند. هنگامی که کشت به مرحله تولید رسید، از یک محیط تولید جداگانه که غلظت مواد مغذی آن افزایش یافته است نیز می‌توان استفاده کرد.
کشت سلولی بچ
Subculture, Researcher transfer mammalian cells from a previous culture to fresh growth medium to increase the cell number

آلودگی های محیط کشت سلولی

اگرچه آلودگی کشت سلولی به طور معمول باکتری‌ها را در بین سلول‌ها و محیط‌های کدر ایجاد می‌کند، اما مهاجمانِ ناخواسته در فلاسک کشت می‌توانند اشکال مختلفی داشته باشند. آلودگی‌های ویروسی و شیمیایی نیز می‌توانند پیامدهای قابل توجهی برای سلامت کشت داشته باشند و اطمینان از عدم آلودگی متقاطع رده‌های سلولی برای تکرارپذیری نتایج بسیار مهم است. بر اساس مطالعات FDA و ATCC، تخمین زده می‌شود که 5 تا 30 درصد از تمام کشت‌های سلولی امروزه تنها به گونه‌های مایکوپلاسما آلوده شده اند. در یک مطالعه میزان آلودگی ویروسی به رده‌های سلولی معمولی از 25 درصد فراتر رفت و ویروس‌های غیر سیتوپاتیک حتی بیشتر از مایکوپلاسما از تشخیص فرار می‌کنند، زیرا سلامت کشت ممکن است سرنخ‌هایی از وجود آن‌ها ارائه ندهد.

کلید کنترل کننده یک آلاینده خاص گاهی به سهولت تشخیص آن مربوط می‌شود. آلودگی‌های باکتریایی، قارچی و مخمر اغلب با چشم غیر مسلح قابل مشاهده هستند و ممکن است به سرعت سلول‌های کشت شده را از بین ببرند، اما ریخت شناسی ظریف ممکن است تشخیص نفوذکنندگان میکروبی قابل توجهی مانند مایکوپلاسما را دشوارتر کند. در مقایسه، ویروس‌ها را نمی‌توان با میکروسکوپ نوری معمولی تشخیص داد و بنابراین کشف آن‌ها اغلب با مشاهده جدا شدن غیرقابل توضیح یا سایر علائم ضعف سلامت سلول‌ها و یا حتی مرگ سلولی صورت می‌گیرد. یکی از مهم‌ترین نگرانی‌های جامعه زیست شناسی در سال‌های اخیر، آلودگی یا حتی تشخیص نادرست خطوط سلولی تحقیقاتی است.

انواع آلودگی های محیط کشت سلولی

آلودگی‌های باکتریایی، قارچی (از جمله کپک‌ها) و مخمرها معمولاً با چشم غیرمسلح به عنوان کدورت سریع و تغییر رنگ محیط کشت (به شرطی که محیط با فنل قرمز، رایج ترین شاخص pH غیر سمی تکمیل شود) قابل مشاهده هستند. میکروسکوپ نوری استاندارد همچنین سلول‌های باکتریایی و ساختارهای قارچی را نشان می‌دهد، بنابراین مشاهده روزانه میکروسکوپی از کشت‌ها، تشخیص زودهنگام آلودگی میکروبی را تضمین می‌کند و به محض آشکار شدن اولین علائم، اقدامات مناسب قابل انجام خواهد بود.

آلودگی باکتریایی کشت سلول
در این تصویر آلودگی باکتریایی در تکنیک کشت سلول نشان داده شده است.

به طور خاص، حذف سریع کشت‌های آلوده برای محافظت از کشت‌های مجاور و همچنین محیط کشت بافت استریل شده از جمله دستگاه‌های انکوباتور، حمام‌ها و کابینت ایمنی زیستی مورد نیاز است. علاوه بر این، آزمایش‌های ویژه برای باکتری‌ها و قارچ‌ها باید به عنوان بخشی از یک روش غربال‌گری معمول و منظم کنترل کیفیت مورد استفاده قرار گیرد. در جدول زیر منابع و دلایل آلودگی‌های رایج محیط کشت سلولی و راه حل آن‌ها نشان بررسی شده اند.

جدول انواع آلودگی‌های محیط کشت سلول و نحوه جلوگیری از آن‌ها

ریشه یا علت آلودگیروش جلوگیری از آن
سطوح و تجهیزات غیر استریلمحل کار را از مواردی که قابل استفاده فوری نیستند پاک کنید.
نشت محیط بر دهانه و بیرون بطری‌ها و روی سطح کاربه طور مرتب با الکل 70 درصد محیط را تمیز کنید. مایعات را نریزید. با پیپت، دستگاه خودکار یا دستگاه انتقال محیط را توزیع کنید.
گرد و غبار رسوبی یا ذرات پوست روی کشت یا بطری ته نشین می‌شود. دست یا دستگاهی که روی بشقاب باز، بطری، ظرف نگه داشته شده است.هرگز دست‌ها را از روی ظروف کشت باز عبور ندهید. هرگز کشت سلول را در بنچ سرباز یا زیر هود لامینار با جریان عمودی انجام ندهید.
گرد و غبار ناشی از پوست، مو یا لباس در محیط کشت افتاده یا دمیده شده است.دست‌ها را کاملاً بشویید، روپوش آزمایشگاهی بدون پرز بپوشید. از روپوش آزمایشگاهی که منحصراً برای اتاق کشت رزرو شده است استفاده کنید.
ذرات معلق هوا در حین صحبت، سرفه، عطسه و غیره.از کار کردن هنگام سرماخوردگی خودداری کنید، یا از ماسک استفاده کنید.
معرف‌ها و محیط‌های غیر استریلقبل از استفاده محلول‌ها را فیلتر یا اتوکلاو کنید.
روش‌های استریل سازی نامناسبعملکرد اتوکلاو را با دماسنج ضبط یا نشان‌گر استریل بودن کنترل کنید. در صورت مشکوک بودن به آلودگی محلول‌های استریل شده را آزمایش یا کشت کنید.
گرد و غبار و هاگ‌ها از محل ذخیره شدهدر بطری‌ها را با فویل بپوشانید و قبل از قرار دادن بطری‌ها در هود، آن‌ها را با 70 درصد الکل پاک کنید.
ظروف غیراستریلاز وسایل یکبار مصرف بسته بندی شده، استریل و یکبار مصرف از تأمین کننده معتبر استفاده کنید. قبل از استفاده اقلام قابل استفاده مجدد را با حرارت خشک استریل کنید.
تماس با سطح غیر استریل یا مواد دیگرهیچ قسمتی از ابزار یا پیپت را که به ظرف کشت منتقل می‌شود، در دست نگیرید.
گرد و غبار و اسپور از دستگاه انکوباتور یا یخچالبه جای درپوش چوب پنبه‌ای از درپوش پیچی استفاده کنید. بطری‌ها را قبل از قرار دادن در هود، تمیز کنید. از محفظه ثانویه برای صفحات استفاده کنید.
فیلتر سوراخ شده یا کثیففیلترها را به طور منظم از نظر وجود سوراخ و نشتی بررسی کنید. افت فشار روی فیلتر را بررسی کنید.
نشت ، به ویژه در شکاف‌ها یا زیر سطح کاربه طور مرتب اطراف و زیر سطح کار را ضدعفونی کنید. بگذارید الکل به شکاف‌ها برود.
آلودگی در حمام‌های آبی که برای گرم کردن محلول‌ها استفاده می‌شود.حمام آب را مرتباً تمیز و ضدعفونی کنید، قبل از انتقال به کابینت ایمنی زیستی برای استفاده در زمان خشک شدن، ظروف را با الکل 70 درصد کاملاً پاک کنید.
آلودگی مشکوک به منبع یا هنگام حمل و نقلاین رده‌های سلولی را به تنهایی، ترجیحاً در قرنطینه کنترل کنید. با پرورش کشت به مدت دو هفته بدون آنتی بیوتیک، آلودگی را بررسی کنید. از نظر بصری، آلودگی را با میکروسکوپ فاز کنتراست و رنگ آمیزی Hoechst/DAPI برای مایکوپلاسما بررسی کنید.

آلودگی مایکوپلاسما در محیط کشت سلول

مایکوپلاسما یک جنس باکتری است که دیواره سلولی ندارد و بنابراین تحت تأثیر آنتی بیوتیک‌هایی که با مهار تشکیل دیواره سلولی، رشد باکتری‌ها را محدود می‌کنند، قرار نمی‌گیرد. مورفولوژی انعطاف پذیر و اندازه سلول مایکوپلاسماها در محدوده 0/15 تا 0/3 میکرومتر به این معنی است که ممکن است از روش‌های استاندارد فیلتراسیون کشت سلولی که اغلب از فیلترهای با منافذ 0/22 میکرومتر استفاده می‌کنند، فرار کنند. برخلاف سایر آلودگی‌های باکتریایی، مایکوپلاسما با بازرسی گاه به گاه آشکار نمی‌شود و به دلیل ریخت شناسی و اندازه کوچک آن‌ها تشخیص با میکروسکوپ نوری دشوار است.

تیتر مایکوپلاسما در کشت می‌تواند بدون ایجاد کدورت محیط به 108 عدد موجود در میلی لیتر برسد. آن‌ها معمولاً سلول‌های پستانداران را که آلوده می‌کنند نمی‌کشند، اما با تغییر متابولیسم سلولی، ایجاد انحرافات کروموزومی، کند شدن رشد سلولی و تداخل در چسبندگی سلولی، به طور قابل توجهی بر کشت تأثیر می‌گذارند. به طور خلاصه، آن‌ها احتمالاً به طور چشمگیری بر نتایج اکثر آزمایش‌های انجام شده با استفاده از رده‌های سلولی آسیب دیده تأثیر می‌گذارند.

آلودگی مایکوپلاسما کشت سلول
عوامل رایج تشخیص DNA مانند DAPI یا Hoechst وجود مایکوپلاسما را در کشتهای آلوده (سمت راست) با استفاده از میکروسکوپ فلورسنت نشان می دهند.

منابع مختلف آلودگی مایکوپلاسما در آزمایشگاه می‌تواند یک چالش باشد. از آنجا که برخی گونه‌های مایکوپلاسما روی پوست انسان یافت می‌شوند، می‌توانند از طریق تکنیک ضعیف آسپتیک، علاوه بر مکمل‌های آلوده مانند سرم گاو جنین، منقل شوند. مایکوپلاسما در بین کشت‌های سلولی آلوده همسایه بسیار قابل انتقال است. برای درمان مایکوپلاسما فیلتر کردن محیط و بافرهای دارای غشای با منفذ 0/1 میکرومتر یا کمتر ضروری است، زیرا دستگاه‌های استاندارد فیلتراسیون محیطی با منافذ 0/22 یا 0/45 میکرومتر قادر به حذف این موجودات کوچک نیستند.

پیشگیری، تشخیص و از بین بردن آلودگی مایکوپلاسما

هنگامی که مایکوپلاسما کشت را آلوده می‌کند، می‌تواند به سرعت به مناطق دیگر آزمایشگاه گسترش یابد. پایبندی دقیق به شیوه‌های آزمایشگاهی خوب، کلیدی است و همچنین آزمایش معمول برای مایکوپلاسما جهت کنترل موفقیت آمیز آلودگی مایکوپلاسما بسیار توصیه می‌شود. سه روش رایج برای تشخیص شامل کشت مایکوپلاسما، روش رنگ آمیزی DNA و تشخیص مبتنی بر PCR است.

آلودگی ویروسی در محیط کشت سلولی

ویروس‌ها از جمله سخت ترین آلاینده‌های کشت سلولی برای تشخیص در کشت هستند و نیاز به روش‌های میکروسکوپی دارند که برای اکثر آزمایشگاه‌های تحقیقاتی غیرممکن است. آن‌ها می‌توانند از منبع سلولی حیوان یا بیمار نشأت بگیرند و چندین رده سلولی با اهمیت بیوتکنولوژیکی حاوی رتروویروس‌های درون زا است. بیشتر اوقات، سلول‌ها توسط ویروس‌های موجود در مواد مشتق از حیوانات که برای کشت آن‌ها استفاده می‌شود، آلوده می‌شوند. اندازه کوچک ویروس‌ها حذف آن‌ها را از محیط، سرم و سایر محلول‌های دارای منشأ بیولوژیکی بسیار مشکل می‌کند. با این حال، از آنجا که اکثر ویروس‌ها محدود به میزبان و حتی بافت هستند، ممکن است ظرفیت آن‌ها برای عفونت بین گونه‌ها یا بافت‌های متقاطع محدود شود. اگرچه ویروس‌ها ممکن است بیش از آنچه بسیاری از محققان تصور می‌کنند در کشت‌های سلولی شایع باشند، اما در صورت عدم ایجاد اثرات سیتوپاتیک یا سایر عوارض جانبی بر سلول‌ها، ممکن است باعث ایجاد اختلال در کشت سلولی شوند.

فراتر از پتانسیل تأثیر آن‌ها بر سلول‌های کشت شده، نگرانی اصلی استفاده از کشت سلولی آلوده به ویروس، خطرات احتمالی سلامتی آن‌ها برای پرسنل آزمایشگاه است. هنگام کار با بافت‌ها یا سلول‌های انسان یا سایر نخستی‌ها باید همیشه از اقدامات احتیاطی ایمنی استفاده کرد تا از انتقال احتمالی عفونت ویروسی (HIV، هپاتیت B، اپشتین بار، ویروس تبخال سیمان B و سایر موارد) از کشت سلولی تا پرسنل آزمایشگاه جلوگیری شود. در مورد روش‌های کار با بافت‌ها، کشت‌ها یا ویروس‌های بالقوه خطرناک باید از کارشناسان ایمنی محیطی سازمانی مشورت گرفت. بهترین روش‌ها برای کاهش بروز آلودگی ویروسی به کشت سلولی شامل موارد زیر است:

  • تعداد منابع بیولوژیکی (تأمین کنندگان، حیوانات) که سلول‌ها از آن‌ها استخراج می‌شود را محدود کنید.
  • حیوانات یا سلول‌هایی را انتخاب کنید که کمتر مستعد ویروس هستند.
  • سلول‌های منبع از مخازن که آزمایش ویروس را انجام می‌دهند و گواهی رده‌های سلولی عاری از ویروس را ارائه می‌دهند.

آلودگی شیمیایی محیط کشت سلولی

هرگونه آلودگی غیر زنده کشت سلولی اغلب به عنوان یک آلاینده شیمیایی طبقه بندی می‌شود. این آلاینده‌ها ممکن است از واکنشگرها یا آب مورد استفاده در محیط‌ها یا بافرها، یا از تجهیزات و منابع سرچشمه بگیرند. به عنوان مثال می‌توان به رادیکال‌های آزاد، یون‌های فلزی، باقیمانده مواد ضدعفونی کننده یا شوینده یا حتی اندوتوکسین‌هایی که بعد از عدم وجود آلودگی‌های باکتریایی در بالادست باقی می‌مانند، اشاره کرد. نکاتی برای جلوگیری از آلودگی شیمیایی در زیر بررسی شده است:

  • همیشه از آب درجه آزمایشگاهی برای تهیه بافرها و محلول‌ها و استفاده مجدد از معرف‌های لیوفیلیزه استفاده کنید.
  • هرگونه ظروف آزمایشگاهی قابل استفاده مجدد باید به طور کامل شستشو داده و در هوا خشک شوند. اتوکلاو هیچ تاثیری روی بقایای مواد شوینده نخواهد داشت.
  • محیط‌ها، مکمل‌ها و سرم (FBS ،FCS) را منحصراً از تأمین کنندگانی که گواهینامه آزمایش اندوتوکسین را ارائه می‌دهند، تهیه کنید.
آلودگی محیط کشت سلول

نکات کلی برای پیش گیری و از بین بردن آلودگی محیط کشت سلول

هنگام کار در کابینت ایمنی زیستی، به یاد داشته باشید که جریان هوا برای کمک به حفظ یک محیط استریل کلید اصلی است. هر دو دریچه عقب و جلو باید همیشه روشن نگه داشته شوند تا جریان هوای مؤثر حاصل شود. قبل از هرگونه کار عملی، کابینت باید به تمام مواد مورد نیاز مجهز باشد تا احتمال انتقال آلودگی‌ها روی آستین و دست اپراتور به حداقل برسد. حداقل بیست دقیقه باید قبل از شروع جریان هوا قبل از قرار دادن وسایل مورد استفاده در کابینت سپری شود. همه مواردی که وارد کابینت می‌شوند باید ابتدا با الکل ۷۰ درصد استریل اسپری شده و با دستمال‌های بدون پرز پاک شوند تا از ورود گرد و غبار و ذرات به داخل کابینت جلوگیری شود. اطمینان حاصل کنید که جریان هوا قبل از باز شدن سطوح یا ظروف به خوبی برقرار شده است تا جریان هوا بتواند محل کار را از ذرات احتمالی پاکسازی شده پاک کند. علاوه بر استفاده صحیح از هود لامینار و کابینت ایمن به درستی نکات دیگری نیز برای جلوگیری از آلودگی‌های محیط کشت سلول وجود دارند که در ادامه به آن‌ها می‌پردازیم.

پیپتینگ و پیش گیری از آئروسل ها

پیپت‌های پلاستیکی یکبار مصرف که پیپت‌های سرولوژیکی نیز نامیده می‌شوند و در حجم های 1 تا 100 میلی لیتر در دسترس هستند ابزارهای ضروری برای کشت سلولی محسوب می‌شوند. برای اطمینان از استریل بودن آن‌ها باید به صورت جداگانه بسته بندی شوند. رعایت دستورالعمل‌های زیر می‌تواند آلودگی و خطرات ایمنی مرتبط با پیپتینگ را به حداقل برساند.

  • از وسایل کمکی پیپت پر کن اتوماتیک استفاده کنید و این نکته را به یاد داشته باشید که هر پیپت پر کنی برای استفاده در یک هود لامینار محدود شده است. برای جلوگیری از آلودگی، قطعات کمکی پیپت را به طور منظم جدا کرده و ضد عفونی کنید. اطمینان حاصل کنید که فیلترهای کمک پیپت به خوبی ذخیره شده و مرتباً تعویض می‌شوند.
  • تا جایی که ممکن است از پیپت‌های وصل شده (در بالا با پنبه متصل شده است) استفاده کنید، مخصوصاً هنگام انتقال مواد از کشیدن مایع به فیش پیپت خودداری کنید. اگر دوشاخه به طور تصادفی خیس شد، بلافاصله فیلتر کمک پیپت را عوض کنید.
  • از لمس كامل پیپت سرولوژی با باز كردن قسمتی، بستن انتهای كمك پیپت و سپس برداشتن آستین كاغذی خودداری كنید.
  • برای جلوگیری از ایجاد آئروسل‌های آلوده، در محیط یا پیپت حباب ایجاد نکنید.

ضد عفونی کردن

روش‌های طراحی شده برای ضدعفونی یا رفع آلودگی زباله‌های کشت، سطوح کار و تجهیزات نه تنها باید خطر آلودگی را به حداقل برساند، بلکه برای پرسنل آزمایشگاه نیز ایمن باشد. هنگام استفاده از اشکال غلیظ ضدعفونی کننده، همیشه از تجهیزات محافظ شخصی مناسب (دستکش و محافظ چشم) استفاده کنید. دستکش‌های انتخاب شده باید در برابر ماده مورد استفاده محافظت کنند. لیست فروش تولید کنندگان به شناسایی بهترین دستکش‌ها برای یک کار خاص کمک می‌کند. مواد ضدعفونی کننده اصلی به گروه‌هایی تقسیم می‌شوند و مزایای نسبی آن‌ها را می‌توان به شرح زیر خلاصه کرد:

هیپوکلریت سدیم یا سفید کننده

  • ضدعفونی کننده عمومی خوب
  • فعال در برابر ویروس‌ها
  • خورنده در برابر فلزات، نباید روی سطوح فلزی مانند سانتریفیوژها استفاده شود.
  • به راحتی توسط مواد آلی غیر فعال می‌شود و بنابراین باید مرتباً تازه تهیه شود.
  • از سفید کننده تجاری برای ایجاد محلول 10 درصد در مایع زباله یا ضد عفونی سطح استفاده کنید.

الکل (اتانول، ایزوپروپانول)

  • غلظت موثر: 70 درصد برای اتانول، 60 تا 70 درصد برای ایزوپروپانول
  • موثر در برابر باکتری‌ها اتانول در برابر اکثر ویروس‌ها مؤثر است، اما در مورد ویروس‌های بدون پوشش مؤثر نیست.
  • ایزوپروپانول در برابر ویروس‌ها مؤثر نیست.
  • آلدئیدها محرک هستند و استفاده از آن‌ها باید محدود باشد.

از ضدعفونی کننده‌های مبتنی بر فنول باید اجتناب کرد، زیرا به عنوان بخشی از برنامه بازنگری دستورالعمل محصولات بیوسیدال اتحادیه اروپا پشتیبانی نمی‌شوند و سمی هستند.

بر اساس رای ۱۱ نفر
آیا این مطلب برای شما مفید بود؟
اگر بازخوردی درباره این مطلب دارید یا پرسشی دارید که بدون پاسخ مانده است، آن را از طریق بخش نظرات مطرح کنید.
منابع:
LabomeSigma AldrichBio CompareNCBI
نظر شما چیست؟

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *