محیط رشد یا محیط کشت ماده‌ای است که میکروارگانیسم‌ها یا سلول‌ها در آن رشد می‌کنند. انواع محیط های کشت مختلفی برای رشد انواع مختلف سلول‌ها وجود دارند. در این مطلب قصد داریم به صورت کامل و جامع انواع محیط‌های کشت باکتری، سلولی، گیاهی و غیره را بررسی کنیم.

فهرست مطالب این نوشته پنهان کردن

انواع محیط های کشت کدام‌ها هستند؟

وقتی نوبت به انجام تحقیقات آزمایشگاهی در علوم زیستی می‌رسد، دانشمندان باید شرایط مناسبی را برای بقا یا رشد سلول‌های زنده ایجاد کنند. کشت سلولی به شرایط محیطی خاصی نیاز دارد. برای رشد و تکثیر بهینه، سلول‌ها به موارد زیر نیاز دارند:

  • کنترل دما
  • pH و اسمولالیته مناسب
  • بستری برای اتصال سلولی
  • نوع خاصی از محیط کشت
  • دستگاه انکوباتور برای حفظ شرایط پایدار

محیط‌های رشد حاوی انواع مواد مغذی لازم برای حفظ رشد میکروارگانیسم‌ها هستند. معمولاً در تهیه انواع محیط های کشت از دو شکل فیزیکی استفاده می‌شود: محیط مایع و محیط رشد جامد. به محیط مایع Broth می‌گویند. محیط رشد جامد معمولاً حاوی آگار بوده که ترکیبی از پلی ساکاریدهای گرفته از جلبک‌های قرمز است. از آن به عنوان عامل جامدسازی استفاده می‌شود زیرا توسط باکتری‌ها تجزیه نمی‌شود، حاوی مواد مغذی قابل استفاده توسط باکتری‌ها نیست، در دمای بالا ذوب می‌شود و در عین حال در دمای مورد استفاده برای رشد اکثر باکتری‌ها جامد است. از محفظه‌های رشد جامد به اشکال پلیت آگار، آگار شیب دار و آگار عمیق استفاده می‌شود. برای ساختن محیط آگار عمیق یا آگار شیب دار، محیط حاوی آگار ذوب شده را در لوله آزمایش می‌ریزند و سپس اجازه می‌دهند تا به صورت عمودی (در آگار عمیق) یا در یک حالت کج (آگار شیب دار) سفت شود. صفحات آگار با ریختن آگار ذوب شده در ظرف پتری ساخته می‌شوند.

انواع محیط کشت
از انواع محیط های کشت مایع و جامد در تحقیقات زیست شناسی و پزشکی استفاده می‌شود.

انواع محیط های کشت بر اساس ساختار کدام‌ ها هستند؟

انواع محیط های کشت را می‌توان بر اساس ترکیبات شیمیایی آن‌ها و یا هدفی که از آن‌ها استفاده می‌شود طبقه بندی کرد. به عنوان مثال از از محیط کشت براث می‌توان برای تعیین الگوهای رشد در محیط مایع و برای انواع خاصی از تلقیح و آزمایشات متابولیک استفاده کرد. آن‌ها همچنین روش انتخابی برای رشد مقادیر زیادی باکتری هستند. شیب‌های آگار معمولاً برای تولید ذخایر باکتری استفاده می‌شوند. از پلیت‌های آگار می‌توان برای جداسازی مخلوط باکتری‌ها و مشاهده ویژگی‌های کلونی گونه‌های مختلف باکتری استفاده کرد. عمیق برای چندین نوع مختلف آزمایش متابولیک متفاوتی استفاده می‌شود (به عنوان مثال، آزمایش هیدرولیز کازئیناز).

در ادامه به بررسی انواع محیط های کشت بر اساس ترکیبات شیمیایی آن‌ها می‌پردازیم.

  • محیط کشت پیچیده یا غنی شده (Complex/Rich). این حالت از انواع محیط های کشت حاوی موادی است که ترکیب شیمیایی دقیق آن‌ها ناشناخته است (مانند خون، عصاره مخمر و غیره) به عنوان مثال TSA LB agar.
  • محیط های کشت مصنوعی یا سنتزی (Synthetic/Chemically defined). این نوع محیط کشت با ترکیب شیمیایی مشخص دقیقاً فرموله شده‌اند.

معرفی فیلم آموزش بیوتکنولوژی میکروبی

فیلم آموزش بیوتک میکروبی

بیوتکنولوژی به معنای استفاده از سلول‌ها و مواد زیستی برای تولید مواد و یا تغییر در فرایندها است. میکروارگانیسم‌ها (Microorganisms) سهم بسیار بزرگی از بیوتکنولوژی را به خود اختصاص داده اند که مبحث بیوتکنولوژی میکروبی، به بررسی این مشارکت می‌پردازد. این حوزه که درس بسیاری از گرایش‌های زیست شناسی به حساب می‌آید آشنایی با میکروارگانیسم های پرکاربرد در حوزه بیوتکنولوژی، تولیدات میکروبی به وسیله میکروارگانیسم‌های نوترکیب و تولید در مقیاس صنعتی را شامل می‌شود.

این آموزش ویدئویی که توسط آقای عارف رحمت‌پناهی کارشناس ارشد بیوتکنولوژی تدریس و به کمک تیم فرادرس تهیه و تدوین شده است شامل سه فصل با عناوین آشنایی با بیوتکنولوژی میکروبی، تولیدات میکروبی و تولید در مقیاس صنعتی است که مطالعه آن برای دانشجویان گرایش‌های مختلف زیست شناسی، بیوتکنولوژی و صنایع غذایی مناسب است.

انواع محیط کشت باکتری

محیط کشت حاوی مواد مغذی و پارامترهای رشد فیزیکی لازم برای رشد میکروبی است. همه میکروارگانیسم‌ها نمی‌توانند در یک محیط کشت واحد رشد کنند و در واقع، بسیاری از آن‌ها نمی‌توانند در هر محیط کشت شناخته شده رشد کنند. موجوداتی که نمی‌توانند در محیط کشت مصنوعی رشد کنند به عنوان انگل‌های اجباری شناخته می‌شوند. Mycobacterium leprae ، Rickettsia ، Chlamydia و Treponema pallidum انگل‌های اجباری هستند. محیط کشت باکتریایی را می‌توان بر اساس ترکیبات، قوام و هدف طبقه بندی کرد.

محیط کشت باکتری

انواع محیط های کشت باکتری بر اساس استحکام

انواع محیط کشت بر اساس حالت فیزیکی آن‌ها به ۳ دسته اصلی جامد، نیمه جامد و مایع تقسیم بندی می‌شوند که در ادامه هر کدام را بیشتر بررسی کرده ایم.

محیط جامد

«محیط جامد» (Solid medium) حاوی آگار در غلظت 1/5 تا 2/0 درصد یا برخی دیگر از عوامل جامد کننده عمدتا بی‌اثر است. محیط جامد دارای ساختار فیزیکی است و به باکتری ها اجازه می‌دهد از نظر فیزیکی به خوبی (به عنوان مثال انواع کلنی‌ها یا رگه‌‌ای‌ها) رشد کنند. محیط جامد برای جداسازی باکتری‌ها یا تعیین ویژگی‌های کلنی جدا مفید است.

محیط نیمه جامد

«محیط نیمه جامد» (Semisolid medium) با آگار در غلظت 0/5 درصد یا کمتر تهیه می‌شود. محیط نیمه جامد دارای قوام نرم مانند کاسترد است و برای کشت باکتری‌های میکروآئروفیلیک یا برای تعیین تحرک باکتری‌ها مفید است.

محیط مایع یا براث

«محیط مایع» (Liquid (Broth) medium) حاوی مقادیر خاصی از مواد مغذی هستند اما اثری از مواد ژل زا مانند ژلاتین یا آگار ندارند. محیط براث برای اهداف مختلفی مانند تکثیر تعداد زیادی از موجودات زنده، مطالعات تخمیر و آزمایش‌های مختلف دیگر مورد استفاده قرار می‌گیرد. به عنوان مثال، در آزمایش تخمیر شکر از MR – VP براث استفاده می‌شود.

انواع محیط کشت باکتری
سه حالت فیزیکی برای ساخت انواع محیط های کشت باکتریایی وجود دارند که شامل جامد، نیمه جامد و مایع هستند.

انواع محیط های کشت باکتریایی بر اساس کاربرد

برای تسهیل تشخیص، شمارش و جداسازی انواع خاصی از باکتری‌ها، بسیاری از انواع محیط های کشت خاص مورد نیاز هستند. برای رفع این نیازها، محیط کشت‌های متعددی در دسترس هستند که در ادامه به بررسی آن‌ها می‌پردازیم.

محیط کشت های عمومی

محیط‌های کشت پایه که محیط کشت همه منظوره نیز نامیده می‌شوند، اساساً محیط‌های رشد ساده‌ای هستند که بسیاری از باکتری‌های با رشد ساده از آن‌ها استفاده می‌کنند. محیط پپتون، نوترینت براث و نوترینت آگار (NA) به عنوان محیط‌های پایه در نظر گرفته می‌شوند. انواع محیط های کشت عمومی غالباً برای جداسازی اولیه میکروارگانیسم‌ها استفاده می‌شوند.

محیط کشت غنی شده

«محیط کشت غنی شده» (Enrichment Media) برای افزایش غلظت نسبی میکروارگانیسم‌ها قبل از کشت روی محیط انتخابی جامد استفاده می‌شود. برخلاف انواع محیط های کشت انتخابی باید گفت محیط کشت غنی شده معمولاً به عنوان محیط براث استفاده می‌شود. محیط‌های کشت غنی شده، محیط‌های مایع هستند که برای مهار سویه‌های مشترک در نمونه بالینی نیز مفید هستند. «سلنیت F براث» ( Selenite F broth)، «تتراسیونات براث» ( tetrathionate broth) و «آلکالین پپتون واتر» (APW) برای بازیابی عوامل بیماری‌زا از نمونه‌های مدفوع استفاده می‌شود.

افزودن مواد مغذی اضافی به شکل خون، سرم، زرده تخم مرغ و غیره به محیط پایه، یک محیط غنی شده می‌سازد. محیط غنی شده برای رشد باکتری‌های «سخت رشد» (Fastidious) استفاده می‌شود. بلاد آگار، شکلات آگار، شیب سرمی Loeffler و غیره چند نمونه از محیط غنی شده است. بلاد آگار با افزودن 5 تا 10 درصد (حجم) خون به یک پایه بلاد آگار تهیه می‌شود. شکلات آگار به آگار خون گرم شده یا آگار خون لیز شده نیز معروف است.

محیط های کشت غنی شده
در این تصویر در سمت راست محیط کشت بلاد آگار و در سمت چپ محیط کشت شکلات آگار از انواع محیط های کشت غنی شده نشان داده شده است.

محیط های کشت انتخابی

محیط کشت انتخابی برای سرکوب رشد برخی از میکروارگانیسم‌ها طراحی شده است در حالی که اجازه رشد برخی دیگر از سویه‌ها را می‌دهد. محیط انتخابی محیطی مبتنی بر آگار (جامد) است به طوری که ممکن است کلنی‌های تک به صورت جدا قرار گیرند. نمونه‌هایی از انواع محیط های کشت انتخابی عبارتند از:

  • تایر مارتین آگار. «تایر مارتین آگار» (Thayer Martin Agar) برای بازیابی باکتری پاتوژن Neisseria gonorrhoeae حاوی آنتی بیوتیک استفاده می‌شود و حاوی آنتی بیوتیک‌های ونکومایسین، کولیستین و نیستاتین است.
  • محیط Manitol Salt Agar و Salt Milk Agar. این دو محیط برای بازیابی S.aureus استفاده می‌شوند حاوی 10 درصد NaCl است.
  • محیط کشت تلوریت پتاسیم. این نوع محیط مورد استفاده برای بازیابی C.diphtheriae حاوی 0/04 درصد تلوریت پتاسیم است.
  • محیط MacConkey’s Agar. این نوع محیط برای اعضای انتروباکتریاسه استفاده می‌شود حاوی نمک صفراوی است که اکثر باکتری‌های گرم مثبت را مهار می‌کند.
  • محیط Pseudosel Agar. یا محیط ستریمید آگار که برای بازیابی Pseudomonas aeruginosa استفاده می‌شود حاوی ستریمید (عامل ضد عفونی کننده) است.
  • محیط Crystal Violet Blood Agar. مورد استفاده برای بازیابی S. pyogenes حاوی 0/0002 درصد کریستال ویوله است.
  • محیط Lowenstein Jensen. که برای رشد عامل M.tuberculosis استفاده می‌شود با ترکیب مالاکیت سبز انتخابی می‌شود.
  • محیط xylose lysine desoxyscholate (XLD). این محیط برای باکتری‌های گرم منفی انتخابی است.
  • ائوزین – متیلن بلو آگار (EMB). محیطی حاوی متیلن بلو است، برای باکتری های گرم مثبت سمی بوده و تنها باعث رشد باکتری‌های گرم منفی می‌شود.
  • YM (مخمر و کپک) که pH کمی دارد، مانع از رشد باکتری‌ها می‌شود.
  • محیط ویلسون آگار و بلر. برای بازیابی S. typhi با افزودن رنگ سبز درخشان انتخابی شده است.
  • محیط های انتخابی مانند TCBS Agar که برای جداسازی Vibrio cholerae از نمونه‌های مدفوع استفاده می‌شود دارای pH بالایی هستند (8/5 تا 8/6)، که اکثر باکتری‌های دیگر را مهار می‌کند.
محیط تی سی بی اس
در این تصویر باکتری‌های ویبریو کلرلا کشت داده شده در محیط TCBS آگار نشان داده شده است.

محیط کشت افتراقی

برخی از انواع محیط های کشت به گونه‌ای طراحی شده اند که می‌توان باکتری‌های مختلف را بر اساس رنگ کلنی‌های آن‌ها تشخیص داد. رویکردهای مختلف شامل ترکیب رنگ‌ها، بسترهای متابولیک و غیره است، به طوری که باکتری‌هایی که از آن‌ها استفاده می‌کنند به عنوان کلنی‌هایی با رنگ متفاوت ظاهر می‌شوند. چنین محیط‌هایی «محیط کشت افتراقی» (Differential/ Indicator Media) یا محیط کشت شاخص نامیده می‌شوند. محیط‌های کشت افتراقی اجازه رشد بیش از یک میکروارگانیسم مورد علاقه اما با کلنی‌های مورفولوژیکی قابل تشخیص را می‌دهند. نمونه‌هایی از محیط‌های کشت افتراقی عبارتند از:

  • نمک‌های مانیتول آگار (تخمیر مانیتول = زرد).
  • بلاد آگار (انواع همولیز یعنی α ، β و γ همولیز)
  • Mac Conkey آگار. (در این محیط تخمیر کننده‌های لاکتوز، کلنی‌های صورتی در حالی که تخمیر کننده غیر لاکتوز کلنی‌های کم رنگ یا بی‌رنگ تولید می‌کند).
  • TCBS. (Vibrio cholerae به دلیل تخمیر ساکارز کلنی‌های زرد ایجاد می‌کند)

محیط کشت انتقالی

نمونه‌های بالینی باید بلافاصله پس از جمع آوری به آزمایشگاه منتقل شوند تا از رشد بیش از حد ارگانیسم‌های آلوده یا هم محیط جلوگیری شده و زنده ماندن عوامل بیماری‌زای بالقوه حفظ شود. این امکان را می‌توان با استفاده از محیط‌های کشت انتقالی به دست آورد. چنین محیطی از خشک شدن نمونه جلوگیری می‌کند، نسبت بیماری‌زا به غیر بیماری‌زا را حفظ می‌کند و از رشد بیش از حد باکتری‌های ناخواسته جلوگیری می‌کند. برخی از این نوع محیط‌ها نیمه جامد هستند. مثال‌هایی از محیط کشت‌های انتقالی در ادامه آمده اند.

  • از «محیط کشت انتقالی کری بلر» (Cary Blair transport medium) و از محیط Venkatraman Ramakrishnan (VR) برای انتقال مدفوع بیماران مشکوک به وبا استفاده می‌شود.
  • «نمک گلیسرول بافر ساخ» (Sach’s buffered glycerol saline) برای انتقال مدفوع بیماران مشکوک به اسهال خونی باسیل استفاده می‌شود.
  • از محیط کشت پایک برای انتقال استرپتوکوک از نمونه‌های گلو استفاده می‌شود.
محیط کشت کری بلر
محیط کشت کری – بلر از انواع محیط های کشت انتقالی است که به صورت نیمه جامد بوده و برای انتقال نمونه‌های مشکوک به وبا از آن استفاده می‌شود.

محیط کشت بی هوازی چیست؟

باکتری‌های بی‌هوازی برای رشد به محیط‌های خاصی احتیاج دارند زیرا به مقدار کم اکسیژن برای کاهش پتانسیل اکسیداتیو و مواد مغذی اضافی نیاز دارند. محیط‌های باکتری‌های بی‌هوازی احتمالا لازم است با مواد مغذی مانند «هِمین» (Hemin یک پورفیرین حاوی آهن با کلر است که می‌تواند از یک گروه هِم، مانند هِم B که در هموگلوبین خون انسان یافت می‌شود، تشکیل شود) و ویتامین K تکمیل شوند. چنین محیطی نیز ممکن است به دلایل فیزیکی یا شیمیایی کاهش یابد. همچنین جوشاندن محیط برای دفع هرگونه اکسیژن محلول مفید است. افزودن 1 درصد گلوکز، 0/1 درصد تیوگلیکولات، 0/1 درصد اسید اسکوربیک، 0/05 درصد سیستئین یا براده آهن داغ می‌تواند باعث کاهش متوسط مقدار ​​شود. قبل از استفاده، این محیط کشت باید در حمام آب جوشانده شود تا اکسیژن محلول خارج شود و سپس با پارافین مایع استریل بسته شود.

محیط کشت Robertson Cooked Meat (RCM) محیطی که معمولاً برای رشد Clostridium spp استفاده می‌شود حاوی یک ستون 2/5 سانتی متری گوشت گاو نر و 15 میلی لیتر نوترینت براث است. Thioglycollate broth حاوی تیوگلیکولات سدیم، گلوکز، سیستین، عصاره مخمر و هیدرولیزات کازئین است. متیلن بلو یا رزازورین یک شاخص پتانسیل کاهش اکسیداسیون است که در محیط گنجانده شده است. تحت شرایط کاهش یافته در واکنش اکسایش کاهش، متیلن بلو بی رنگ است.

محیط رابرتسون
محیط کشت RCM از انواع محیط های کشت بی هوازی در این تصویر نشان داده شده است.

معرفی فیلم آموزش آزمایشگاه میکروبیولوژی ۱

فیلم آموزش آزمایشگاه میکروبیولوژی

میکروارگانیسم‌ها در تمام ابعاد زندگی بشر از جمله: در حوزه‌های سلامت، صنعت، کشاورزی، انرژی، بالا بردن کیفیت و کمیت زندگی بشر و غیره نقش دارند، از این رو ضرورت دارد تا جنبه‌های مختلف زیست شناسی میکروارگانیسم‌ها مورد مطالعه، کشف و بررسی قرار بگیرد. هدف از این فرادرس، آشنایی دانشجویان دوره کارشناسی رشته‌های: زیست شناسی میکروبی، میکروبیولوژی و زیست شناسی سلولی و مولکولی با انواع روش‌های کشت، تهیه محیط‌های کشت میکروبی، جداسازی، خالص سازی و رنگ آمیزی گروه‌های مختلف میکروارگانیسم‌ها است و همچنین راه‌های مقابله و انواع روش‌های کشت میکروارگانیسم‌ها از جمله دیگر اهداف آموزشی این درس است.

این آموزش ویدئویی توسط خانم آزیتا تیشه یار دانشجوی دکترای زیست‌شناسی سلولی و مولکولی گرایش ژنتیک از دانشگاه آزاد اسلامی با توجه به ضرورت آشنایی با تکنیک‌ها و مباحث آزمایشگاه میکروبیولوژی ۱ تدریس و با همراهی تیم فرادرس تهیه و تدوین شده است. در این فرادرس طی یازده فصل به مباحثی مانند آشنایی با مقررات و ایمنی کار در آزمایشگاه میکروبیولوژی، آشنایی با انواع محیط های کشت و نحوه تهیه آن‌ها، آشنایی با انواع روش‌های کشت، آشنایی با مشخصات کلنی میکروارگانیسم‌ها (Microorganism)، مشاهده میکروارگانیسم‌ها، آشنایی با رنگ‌ها، ساز و کار و عملکرد آن‌ها، انواع رنگ‌امیزی‌ها و آشنایی با محیط کشت‌های اختصاصی و افتراقی پرداخته شده است و برای دانشجویان گرایش‌های مختلف زیست شناسی مناسب است.

انواع محیط های کشت سنجشی

از انواع محیط های کشت سنجشی برای سنجش ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه و آنتی بیوتیک‌ها استفاده می‌شوند. به عنوان مثال از روش سنجش آنتی بیوتیک برای تعیین قدرت آنتی بیوتیک با روش سنجش میکروبیولوژیکی استفاده می‌شود. انواع دیگر محیط‌های کشت سنجشی به منظورهای زیر استفاده می‌شوند.

  • محیط کشت جهت شمارش باکتری‌ها
  • محیط کشت‌های مشخص کننده باکتری‌ها
  • محیط کشت‌های نگه‌داری و غیره.

محیط های کشت سلولی چه هستند؟

محیط کشت سلولی، که به عنوان محیط رشد شناخته می‌شود، یک اصطلاح شامل هر ژل یا مایع ایجاد شده برای حمایت از رشد سلولی در یک محیط مصنوعی است. وقتی دانشمندان سلول‌ها، اندام‌ها یا بافت‌ها را از موجودات زنده جدا می‌کنند، باید آن‌ها را در یک محیط مصنوعی مناسب نگه‌داری کنند. یک محیط کشت نقش مهمی در فناوری کشت سلولی ایفا می‌کند و از تحقیقات سلولی آزمایشگاهی پشتیبانی می‌کند. محیط کشت سلولی مواد مغذی لازم برای زنده ماندن و تکثیر سلولی را تأمین می‌کند. محیط رشد همچنین اسمولالیته و pH مناسب را ارائه می‌دهد. هنگام انتخاب محیط رشد مناسب، دانشمندان باید نوع سلول خود را در نظر بگیرند.

انواع مختلفی از محیط کشت سلولی وجود دارد که سلول‌های پستانداران، گیاهان، حشرات، باکتری‌ها، مخمرها، ویروس‌ها و موارد دیگر را در خود جای می‌دهند. انتخاب محیط کشت سلولی به طور مستقیم بر نتایج یک آزمایش تأثیر می‌گذارد و بنابراین، باید به دقت مورد توجه قرار گیرد. محیط کشت سلولی شامل مجموعه‌ای از ترکیبات و مواد مغذی است که برای حمایت از رشد سلولی طراحی شده اند. اجزای رایج محیط کشت سلولی عبارتند از:

  • اسیدهای آمینه. هر محیط کشت سلولی حاوی مخلوطی از آمینو اسیدها، بلوک‌های سازنده پروتئین است. اسیدهای آمینه ضروری و غیر ضروری ممکن است برای افزایش زنده ماندن و رشد سلول استفاده شود.
  • ویتامین‌ها. ویتامین‌ها برای تسهیل رشد و تکثیر سلولی گنجانده شده اند. از سرم به عنوان منبع بسیاری از ویتامین‌ها در محیط‌های حاوی سرم استفاده می‌شود، اما باید ویتامین‌ها را به محیط بدون سرم اضافه کرد.
  • کربوهیدرات‌ها. کربوهیدرات‌ها منبع انرژی برای سلول‌های زنده هستند. معمولاً از گلوکز استفاده می‌شود، اما کربوهیدرات‌های دیگر مانند گالاکتوز، فروکتوز یا مالتوز در دسترس هستند.
  • نمک‌های غیر آلی. نمک‌های معدنی برای تنظیم پتانسیل غشایی و اسمولالیته مورد نیاز هستند.
  • عناصر اساسی و کمیاب. سلول‌ها برای رشد به عناصری مانند آهن، پتاسیم، منیزیم و روی نیاز دارند.
  • سرم. سرم شامل فاکتورهای رشد و مهار کننده‌ها، هورمون‌ها، مهار کننده‌های پروتئاز، شلاتورها، اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌ها، لیپیدها، ویتامین‌ها، عناصر کمیاب، مواد معدنی و موارد دیگر است که برای رشد سلولی مورد نیاز است. معمولاً در کشت‌های سلولی از سرم گاو استفاده می‌شود.
  • هورمون‌ها. ممکن است هورمون‌های خاصی برای تأثیر بر عملکرد، رشد و تکثیر سلول‌ها اضافه شوند.
  • سیستم‌های بافری. سیستم‌های بافری pH را تنظیم می‌کنند.
  • مکمل‌ها. مکمل‌هایی مانند هورمون‌ها، مهار کننده‌های آنزیم و عناصر کمیاب گاهی به محیط کشت سلولی اضافه می‌شوند که نوع سلول و هدف تحقیق را برآورده می‌کند.
  • آنتی بیوتیک‌ها. آنتی بیوتیک‌ها به محیط کشت سلولی اضافه می‌شوند تا از رشد قارچ و باکتری جلوگیری کنند. آنتی بیوتیک‌ها به دلیل پروتئین‌هایی که مقداری از بار آنتی بیوتیک را متصل می‌کنند، برای محیط سرم مناسب ترین هستند. در مقابل، سلول‌های موجود در محیط‌های بدون سرم بیشتر در معرض سمیت آنتی بیوتیکی هستند.
محیط کشت سلولی
در این تصویر دو نوع از محیط‌های کشت سلولی نشان داده شده است.

انواع محیط کشت سلولی

محیط کشت سلولی را می‌توان به دو دسته اصلی تقسیم کرد: محیط‌های طبیعی و محیط‌های مصنوعی. محیط‌های طبیعی آن‌هایی هستند که از استخراج بافت یا مایعات بدن حیوانات مانند پلاسما، لنف و سرم مشتق شده اند. محیط‌های طبیعی را می‌توان به سه گروه تقسیم کرد:

  • مایعات بیولوژیکی: نمونه‌ها شامل سرم، پلاسما، لنف و مایع آمنیوتیک است.
  • عصاره‌های بافتی: نمونه‌هایی شامل جنین، مغز استخوان، تومور و عصاره کبد هستند.
  • لخته یا منعقد کننده: به عنوان مثال می‌توان به لخته شدن پلاسما و مواد منعقد کننده اشاره کرد.

سرم رایج ترین ماده طبیعی است. سرم حتی به عنوان مکمل در کشت‌های سنتزی استفاده می‌شود. سرم گاوی به دلیل مزایای متعدد، از جمله منابع فراوان و زمان طولانی استفاده، محبوبیت زیادی دارد. محیط‌های مصنوعی (که به عنوان محیط‌های کشت سنتزی نیز شناخته می‌شوند) آن‌هایی هستند که با استفاده از انواع ترکیبات آلی و معدنی ایجاد شده اند. محیط‌های مصنوعی عبارتند از:

  • محیط حاوی سرم: محیط مصنوعی که در آن از سرم مکمل استفاده می‌شود.
  • محیط‌های بدون سرم: محیط‌های بدون سرم (SFM) قوام بیشتری نسبت به محیط‌های حاوی سرم ارائه داده و به محققان اجازه می دهند بدون نیاز به سرم از رشد و تکثیر سلولی حمایت کنند.
  • محیط‌های شیمیایی تعریف شده: محیط‌های شیمیایی تعریف شده فاقد هرگونه آلودگی هستند که فقط از اجزای آلی و معدنی تصفیه شده تشکیل شده اند.
  • محیط بدون پروتئین: محیط بدون پروتئین حاوی پروتئین نیست. مکمل‌های پروتئینی بر اساس نیاز اضافه می‌شوند.
  • محلول‌های متعادل نمک (BSS): BSS به تنهایی برای زنده نگه داشتن سلول‌ها استفاده می‌شود. BSS غنی شده با مواد مغذی و سایر ترکیبات برای ایجاد محیط کشت قادر به حمایت از رشد و تکثیر سلولی است.
محیط BSS
محیط BSS که به عنوان محیط غنی شده به کار می‌رود.

محیط‌های بدون سرم (SFM) اغلب به دو دسته اصلی پایه یا پیچیده طبقه بندی می‌شوند. محیط‌های پایه آن‌هایی هستند که مکمل ندارند. هنگامی که مکمل‌های رشد به یک محیط پایه اضافه می‌شوند، به یک محیط پیچیده تبدیل می‌شوند. در جدول زیر لیستی از برخی محیط‌های رایج کشت سلولی آمده است.

نام محیط کشت نوع محیط کشت توضیحات
MEM (محیط حداقل ​​ضروری) محیط پایه این محیط که به عنوان محیط حداقل ضروری ایگل (EMEM) نیز شناخته می‌شود، برای کشت‌های اولیه و دیپلوئید استفاده می‌شود. MEM ها فقط حاوی ویتامین‌ها، اسیدهای آمینه غیر ضروری، نمک‌های معدنی و گلوتامین هستند.
DMEM (محیط ایگل اصلاح شده دولبکو) محیط پایه مشابه MEM، اما دارای آمینو اسیدها و ویتامین‌های اضافی است. فاقد محرک رشد یا پروتئین است.
IMDM (محیط اصلاح شده دولبکو Iscove) محیط پیچیده نسخه اصلاح شده DMEM با اسیدهای آمینه و ویتامین‌های بیشتر. حاوی آهن نیست اما دارای سلنیوم و نیترات فریک است. مناسب برای کشت‌های با چگالی بالا
RPMI-1640 محیط پیچیده محیطی که برای اکثر انواع سلول‌های پستانداران کار می‌کند. یکی از محیط‌های پرکاربرد است.
Ham’s F-10 و F-12 محیط‌های بدون سرم محیط F-10-Ham مخلوط اصلی مواد مغذی ژامبون بود که برای استفاده با سلول‌های تخمدان همستر چینی (CHO) طراحی شده بود. این محیط برای استفاده از سلول‌های دیپلوئید انسانی مناسب است. F-12-Ham پیچیده‌تر است و برای سلول‌های اپیتلیال پروستات موش صحرایی و سلول‌های کبدی موش مناسب است.

نکات انتخاب محیط کشت سلولی

مهم‌ترین مرحله تعیین نوع محیط کشت، سلولی است که باید در کشت استفاده شود. با وجود تعداد زیادی محیط تجاری، یافتن انتخاب مناسب می‌تواند ترسناک باشد. با تحقیق در مورد رده سلولی که از آن استفاده می‌کنید، تعیین کنید که چه محیط‌های مختلف کشت توصیه می‌شود. سپس می‌توانید چند مورد را انتخاب کرده و آن‌ها را امتحان کنید تا ببینید چه چیزی بهتر عمل می‌کند. در اینجا برخی از عوامل را باید در نظر گرفت.

آماده سازی محیط کشت

انواع محیط های کشت سلولی به سه شکل وجود دارند:

  • محیط پودری: محیط پودری کم‌ترین هزینه را دارد اما باید توسط محقق تهیه و ضدعفونی شود.
  • محیط غلیظ: محیط غلیظ فقط باید توسط محقق رقیق شود.
  • محیط آماده: محیط‌های آماده به کار یا Working solution ساده ترین نوع محیط‌ها هستند. آن‌ها طوری طراحی شده اند که بدون هیچ گونه دستکاری توسط محقق مورد استفاده قرار گیرند.
محیط کشت های پودری
انواع محیط های کشت خشک و پودری می‌توانند در کشت سلول استفاده شوند که مقرون به صرفه بوده اما استفاده از آن‌ها زمان بر است.

نوع محیط مورد استفاده سنتزی یا طبیعی

همه محیط‌های کشت سلولی به یکی از دو دسته تعلق دارند: محیط‌های طبیعی یا محیط‌های مصنوعی. هر کدام مزایا و معایب خاص خود را دارند که در انتخاب شدن توسط محققان برای آزمایش تاثیر می‌گذارند. به عنوان مثال محیط سرمی با حذف همالوسین از پلاسما ایجاد می‌شود. مخلوط حاصل شامل ترکیبی از اجزایی است که برای رشد و تکثیر سلولی ارزشمند هستند. مزایای محیط سرمی شامل موارد زیر است:

  • شامل انواع مختلفی از مواد مغذی سلولی مانند اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها، مواد معدنی و اسیدهای چرب است.
  • اجزایی را فراهم می‌کند که امکان چسبندگی سلولی را فراهم می‌کنند.
  • شامل انواع عوامل رشد و هورمون‌ها است.

اما محیط‌های سرمی معایبی نیز دارند که در ادامه آن‌ها را بررسی کرده ایم:

  • فاقد یکنواختی ترکیب بوده و برای آزمایش در مقیاس بزرگ مناسب نیست.
  • حاوی برخی از ترکیبات است که آن‌ها می‌توانند برای رشد انواع خاصی از سلول‌ها مضر بوده یا از رشد آن‌ها جلوگیری کنند.
  • در مقایسه با محیط‌های مصنوعی خطر بیشتری برای آلودگی دارند.
  • ممکن است جداسازی محصولات کشت سلولی را پیچیده کند.
  • ممکن است گران قیمت باشند.

محیط‌های مصنوعی دارای مزیت متمایزی از نظر پایداری و قوام هستند بنابراین محققان می‌توانند مطمئن باشند که از محیط کشت یکسانی استفاده می‌کنند، حتی زمانی که تحقیقات خود را افزایش می‌دهند. علاوه بر این، محیط‌های مصنوعی معمولاً ارزان‌تر از محیط‌های مبتنی بر سرم هستند. با این حال، استفاده از محیط‌های بدون سرم مضراتی دارد از جمله اینکه این محیط‌ها نسبت به افراط، از جمله دما، pH و اسمولالیته حساس‌تر هستند.

محیط کشت سرم
انواع محیط های کشت حاوی سرم در این تصویر نشان داده شده است.

انتخاب محیط اختصاصی

پس از انتخاب بین محیط‌های طبیعی و مصنوعی، باید یک محیط خاص را انتخاب کنید. بسیاری از آزمایشگاه‌ها از محیط‌های تجاری استفاده می‌کنند و کیفیت و ثبات را با حداقل تلاش ممکن می‌سازند. برای یافتن بهترین مورد محیط رشد، باید از خود سوالات زیر را بپرسید:

  • از چه نوع سلولی استفاده خواهید کرد و نیازهای آن‌ها چیست؟
  • آزمایشگاه شما چه قابلیت‌ها و محدودیت‌هایی دارد؟
  • هدف از آزمایش چیست؟

به عنوان مثال، سلول‌های بنیادی به محیط‌هایی نیاز دارند که بتوانند نگه‌داری، تمایز، گسترش و برنامه‌های پایین دستی را تسهیل کنند. از آنجا که سلول‌های بنیادی همه کاره هستند، باید شرایط محیط آن‌ها را به دقت زیر نظر گرفت تا محققان به چیزی غیر از هدف خود دست نیابند. محیط‌های تجاری خاصی برای استفاده سلول‌های بنیادی مانند RPMI-1640 طراحی شده اند که با انواع خاصی از سلول‌های بنیادی به خوبی کار می‌کنند. اگر مطمئن نیستید کدام محیط بهتر است، شرکت‌های تهیه و تولید محیط کشت می‌توانند به شما در محدود کردن گزینه‌های خود کمک کنند. مطمئن شوید که سلول‌ها، اهداف و مشخصات آزمایشگاه خود را درک کرده اید تا بهترین محیط مناسب را انتخاب کنید.

محیط RPMI-1640
از محیط RPMI-1640 برای کشت انواع سلول‌های بنیادی استفاده می‌شود.

معرفی فیلم آموزش مبانی نظری آزمایشگاه میکروبیولوژی ۲

فیلم آزمایشگاه میکروبیولوژی ۲

از آنجایی که میکروارگانیسم‌ها در ارتباط مستقیم با موجودات زنده و محیط پیرامون ما هستند، تشخیص و شناسایی دقیق آن‌ها می تواند درک درستی نسبت به پاتوژن بودن و یا عدم آن را در اختیار ما قرار دهد و بدین وسیله راه ابتلا به بسیاری از بیماری‌های عفونی را بسته نگه دارد. اصول پایه میکروب شناسی، امری واجب و ضروری برای هر میکروبیولوژیست به محض ورود به آزمایشگاه است.

این آموزش ویدئویی توسط خانم اسما غلامی، دانشجوی دکتری میکروبیولوژی دانشگاه شهید بهشتی در هشت فصل تدریس و با همکاری تیم فرادرس تهیه و تدوین شده است. در این فرادرس در ابتدا هدف آشنایی دانشجویان با نحوه صحیح کار کردن در آزمایشگاه میکروبیولوژی است و در نهایت دانشجویان با مواردی همچون دنیای میکروارگانیسم‌ها و تنوع آن‌ها، اصول اولیه رنگ آمیزی، بررسی خصوصیات فیزیک و شیمیایی، بررسی اثر عوامل محیطی و انواع آزمون‌های بیوشیمیایی جهت تشخیص، آشنا می‌شوند. این فرادرس برای دانشجویان رشته‌های میکروبیولوژی و گرایش‌های مختلف زیست شناسی مناسب است.

محیط کشت گیاهی

تکنیک کشت بافت روشی شگفت انگیز برای شبیه سازی گیاهان، حفظ مخزن ژنی و نجات گونه‌های در معرض خطر است. این یک تکنیک ارزشمند برای محققان است. انواع محیط های کشت گیاهی مواد مغذی ضروری مورد نیاز برای رشد و نمو گیاهان در آزمایشگاه‌ها را تأمین می‌کند. انتخاب صحیح محیط یک مرحله مهم برای کشت In Vitro سلول‌های گیاهی است. بسیاری از ما نمی‌دانیم که چه نوع محیط کشتی وجود دارد، چه کاربردهایی دارد و کدام محیط برای کشت مناسب‌تر است. بسیار مهم است که بدانید از چه محیطی استفاده می‌کنید و چگونه محیط‌های مناسب برای کشت‌های خود را انتخاب کنید. شما باید نیاز گیاه خود را بفهمید و سپس غذای مورد نیاز برای رشد آن را تهیه کنید. اجزای اصلی محیط کشت گیاهی شامل موارد زیر است:

درشت مغذی‌ها

شامل عناصری مانند نیتروژن، فسفر ، کلسیم، منیزیم، پتاسیم، گوگرد و کربن (جداگانه اضافه شده) است. این عناصر برای رشد و نمو گیاه مورد نیاز است. جدول زیر محدوده غلظت عناصر را نشان می‌دهد که باید در محیط اضافه شود.

عناصر مقدار غلظت قابل قبول
نیتروژن ۲۵ تا ۶۰ میلی مولار
پتاسیم ۲۰ تا ۳۰ میلی مولار
فسفر، کلسیم، منیزیم ۱ تا ۳ میلی مولار

ریز مغذی‌ها

ریز مغذی‌ها به مقدار کمی مورد نیاز هستند، با این حال، آن‌ها نقش اساسی و عظیمی در رشد سلول و بافت ایفا می‌کنند. شامل عناصری مانند آهن، منگنز، روی، بور، مس و مولیبدن هستند. آهن برای همه عناصر دیگر بسیار مهم است و از آن با شلات کردن آن با EDTA در کشت‌ها استفاده می‌شود. در محیط‌های خاص، عناصری مانند کبالت، ید، سدیم یا کلرید نیز استفاده می‌شود، حتی اگر اهمیت آن‌ها در رشد سلول‌ها به خوبی درک نشده باشد. در جدول زیر عناصر ریزمغذی و مقادیر غلظت قابل قبول آن‌ها در محیط‌های کشت گیاهی ذکر شده است.

عناصر مقدار غلظت قابل قبول
کبالت، ید ۰/۱ میکرو مولار
آهن، مولیبدن ۰/۱ میکرو مولار
ید ۵ میکرو مولار
روی ۵ تا ۳۰ میکرو مولار
بور ۲۵ تا ۱۰۰ میکرو مولار
منگنز ۲۰ تا ۹۰ میکرو مولار

مکمل های ارگانیک

انواع مکمل‌های ارگانیک از جمله ویتامین‌ها، آمینواسیدها و انواع عصاره‌های آلی هر کدام به منظور خاصی به انواع محیط‌های کشت گیاهی اضافه می‌شوند. در ادامه انواع ترکیبات آلی مهم که برای رشد و تمایز گیاه و سلول‌های گیاهی لازم هستند را بررسی کرده ایم.

ویتامین ها

سنتز ویتامین‌ها توسط گیاهان در مقادیر ناکافی انجام می‌شود. به همین دلیل، محیط کشت با ویتامین‌ها تکمیل می‌شود. آن‌ها برای رشد و تمایز گیاهان مورد نیاز هستند. انواع ویتامین‌ها شامل: تیامین، ریبوفلاوین، نیاسین، پیریدوکسین، اسید فولیک، پانتوتنیک اسید، بیوتین، اسید اسکوربیک، میوینوزیتول، پارامینو بنزوئیک اسید و ویتامین E هستند. ویتامین‌هایی که بیشتر در محیط کشت مورد استفاده قرار می‌گیرند عبارتند از تیامین (B1)، نیکوتینیک اسید و پیریدوکسین (B6). در جدول زیر مقادیر مورد نیاز و معمول آن‌ها را ذکر کرده ایم.

ویتامین‌ها غلظت قابل قبول
تیامین ۰/۱ تا ۱۰ میلی گرم در لیتر
نیکوتینیک اسید ۰/۵ تا ۵ میلی گرم در لیتر
پیریدوکسین ۰/۱ تا ۱۰ میلی گرم در لیتر

میوئینوزیتول

از این ماده در محیط‌های کشت برای تحریک رشد گیاهان، به ویژه فرایند تقسیم سلولی استفاده می‌شود. میوئینوزیتول به اسید اسکوربیک و پکتین تجزیه می‌شود و در فسفواینوزیتیدها و فسفاتیدیل اینوزیتول ترکیب شده و در محیط کشت بین محدوده غلظت 50 تا 5000 میلی گرم در لیتر استفاده می‌شود.

آمینو اسیدها

آمینو اسیدها منبع نیتروژن برای سلول‌ها هستند، زیرا می‌توانند به راحتی توسط گیاهان در مقایسه با نیتروژن معدنی جذب شود. اسیدهای آمینه در تقویت رشد سلولی در کشت از جمله ایجاد سلول‌های کشت و پروتوپلاست‌ها نقش دارند. اسیدهای آمینه‌ای که اغلب به محیط اضافه می‌شوند عبارتند از هیدرولیزات کازئین، L – گلوتامین، L – آسپاراژین و آدنین. برخی دیگر از اسیدهای آمینه که برای افزایش رشد سلولی استفاده می‌شوند عبارتند از گلایسین، گلوتامین، ال آرژنین، آسپاراژین، تیروزین و سیستئین. در جدول زیر مقادیر معمول هر کدام از آن‌ها در محیط کشت را ذکر کرده ایم.

آمینو اسید مقادیر غلظت قابل قبول
هیدرولیزات کازئین ۰/۲۵ تا ۱ گرم در لیتر
گلایسین ۲ میلی گرم در لیتر
گلوتامین ۸ میلی مولار
آسپاراژین، تیروزین ۱۰۰ میلی گرم در لیتر
آرژنین، سیستئین ۱۰ میلی گرم در لیتر

عصاره های ارگانیک

این قبیل عصاره‌ها شامل موادی هستند که از منابع طبیعی مانند هیدرولیزات پروتئین، شیر نارگیل، عصاره مخمر، عصاره مالت، موز آسیاب شده، آب پرتقال و آب گوجه فرنگی استخراج شده اند. آن‌ها در تقویت رشد گیاه نقش دارند. اشکال این عصاره‌های آلی این است که آن‌ها از نظر کمی و کیفی عوامل محرک رشد متفاوت هستند. گاهی زغال فعال نیز بسته به سلول‌های گیاهی مورد کشت به محیط افزوده می‌شود، وقتی این ماده به محیط کشت گیاهانی مانند هویج، گوجه فرنگی، ارکیده و پیاز اضافه می‌شود، رشد سلول‌ها را تحریک می‌کند. این در حالی است که افزودن این ماده به محیط کشت تنباکو و سویا منجر به مهار رشد آن می‌شود.

عوامل جامد کننده

این گونه مواد سطح کشت را تقویت کرده و به این ترتیب از استقرار و رشد کشت حمایت می‌کنند. این دو نوع شامل آگار و ژلاتین هستند که در ادامه در مورد هر کدام بیشتر توضیح می‌دهیم.

  • آگار. این یک پلی ساکارید و یک ماده ژل کننده جهانی است که از جلبک دریایی جدا شده است. این ماده یک سطح جامد یا نیمه جامد برای کشت سلولی تشکیل می‌دهد. این یک ماده جامد کننده است که به طور گسترده و عمدتاً به دو دلیل استفاده می‌شود، اول با سایر ترکیبات محیط واکنش نشان نمی‌دهد و دوم توسط آنزیم‌های گیاهی هضم نمی‌شود. غلظت آگار، مورد استفاده در محیط کشت سلولی بین 0/8 تا 1/0 است.
  • ژلاتین. این ماده از پپتید و پروتئین تشکیل شده است که از هیدرولیز کلاژن تولید می‌شود. کاربرد آن در مقایسه با آگار محدود است، زیرا در دمای 25 درجه سانتی‌گراد ذوب می‌شود و خاصیت ژل شدن خود را از دست می‌دهد.
پودر ژلاتین
از پودر ژلاتین مانند آگار برای جامد کردن انواع محیط های کشت گیاهی استفاده می‌شود.

تنظیم کننده های رشد گیاهان در محیط کشت

از ماده‌ها و هورمون‌های مختلفی جهت تنظیم رشد سلول‌های گیاهی و گیاهچه‌ها استفاده می‌شود که از انواع آن‌ها می‌توان اکسین، سیتوکینین، ژیبریلین و انواع آنتی بیوتیک‌ها را نام برد. در ادامه به بررسی نقش هر کدام بیشتر می‌پردازیم.

اکسین

این ماده بر دو نوع است: طبیعی که شامل ایندول استیک اسید (IAA) و مصنوعی شامل ایندول – 3 – بوتیریک اسید (IBA)، 2و4 – دی کلروفنوکسی استیک اسید (2و4-D) و نفتالن استیک اسید ( NAA). برای تقسیم سلولی و فرایندهای طویل شدن سلولی مورد نیاز است. بسته به غلظت آن، می‌تواند منجر به تشکیل کالوس (در غلظت بالا) یا ریشه (در غلظت کم) شود. رایج ترین، مؤثرترین و پرکاربرد ترین اسید استیک در محیط کشت، 2 و 4 – D اسید استیک است.

سیتوکینین

سیتوکینین‌های مختلف مورد استفاده در محیط کشت عبارتند از BAP یا (6 – benzyloaminopurine)، ۲iP یا (6 -dimethylaminopurine)، کاینتین، زئاتین و TDZ. این ترکیبات باعث تقسیم سلولی می‌شوند که منجر به تشکیل انشعاب و انشعاب جانبی می‌شود. همچنین در تاخیر در تشکیل ریشه دخیل است. رایج ترین و پرکاربردترین سایتوکینین‌ها در محیط کشت، کینتین و بنزیل آمینو پورین هستند.

تعیین نسبت اکسین به سیتوکینین قبل از افزودن آن‌ها به محیط بسیار مهم است. از آنجا که نسبت بیشتر اکسین به سیتوکینین فرآیندهایی مانند جنین زایی، شروع کالوس و شروع ریشه را ترویج می‌کند. در حالی که نسبت کمتر اکسین به سیتوکینین باعث تکثیر انشعاب و ساقه می‌شود. بنابراین، مهم است که بدانید از کشت چه می‌خواهید. تعیین نسبت نیز بستگی به نوع ریزنمونه و گونه‌های گیاهی دارد که در آزمایشگاه کشت می‌شوند.

ژیبریلین

این عضو از اسیدهای کربوکسیلیک تیتراسیکلیک دیترپنوئید است. در حال حاضر، حدود 20 نوع GA به عنوان تنظیم کننده رشد گیاه شناخته شده است، از این تعداد، ژیبریلین A3 معمولاً در محیط کشت استفاده می‌شود. عملکرد آن‌ها شامل رشد کالوس و افزایش طول گیاهان کوتوله است. آن‌ها همچنین در مهار تشکیل ریشه و ساقه نقش دارند.

ابسیزیک اسید

این ماده بسته به گونه‌های گیاه کشت شده، می‌تواند رشد کالوس را تحریک یا مهار کند. همچنین تکثیر ساقه را تحریک کرده و مرحله بعدی جنین زایی را مهار می‌کند.

آنتی بیوتیک ها

گاهی اوقات لازم است آنتی بیوتیک‌ها را به محیط کشت اضافه کنید تا کشت خود را از حمله میکروارگانیسم‌ها نجات دهید. عمدتاً، غلظت پایین کانامایسین و استرپتومایسین در محیط کشت استفاده می‌شود. با این حال، باید از مصرف آنتی بیوتیک‌ها اجتناب کرد زیرا مانع از رشد سلول‌ها نیز می‌شود. بهترین جایگزین برای آنتی بیوتیک‌ها PPM (مخلوط نگه‌دارنده گیاه) است. استفاده از آن کشت شما را از هر نوع میکروارگانیسم چه در هوا، چه در آب، چه درون زا یا ناشی از تماس انسان محافظت می‌کند. علاوه بر این، بهترین ویژگی‌های PPM عبارتند از:

  • این اثر مهاری بر رشد کالوس ندارد.
  • در برابر حرارت پایدار است و می‌توان آن را با محیط کشت بافت اتوکلاو کرد.
کشت گیاهی

انواع محیط های کشت گیاهی

تعدادی از محیط‌های کشت گیاهی تا به امروز شناخته شده اند مانند محیط MS، محیط B5، محیط LS، محیط White’s و غیره. این بخش به اختصار پنج محیط کشت پرکاربرد گیاهی در آزمایشگاه‌ها را به شما ارائه می دهد.

محیط Murashige و Skoog یا (MS)

این محیط توسط دو دانشمند به نام‌های توشیو موراشیگه و فولکه کی اسکوگ در سال 1962 هنگامی که این دو دانشمند در حال کار بر روی کشف تنظیم کننده‌های رشد گیاه بودند، اختراع شد. این رایج ترین محیط مورد استفاده در آزمایشگاه کشت بافت است. گاهی اوقات ممکن است برخی از اعداد را در پشت MS مشاهده کنید که نشان دهنده غلظت ساکارز در محیط است. به عنوان مثال، MS0 نشان دهنده عدم وجود ساکارز و MS10 نشان دهنده وجود 10 گرم در لیتر ساکارز در محیط است. این فرمولاسیون ترکیبی از مواد مغذی مانند نمک‌های غیر آلی، ویتامین‌ها و اسیدهای آمینه است. از این محیط برای القاء ارگانوژنز، کشت کالوس، ریزازدیادی و تعلیق سلولی استفاده می‌شود.

محیط Linsmaier و Skoog یا (LS)

این محیط توسط Linsmaier و Skoog در سال 1965 توسعه یافت. از آن اولین بار برای بهینه سازی مکمل‌های ارگانیک کشت تنباکو استفاده شد. این محیط دارای ترکیب مشابهی با Murashige و Skoog با پیچیدگی ویتامین‌های Linsmaier و Skoog است. او دریافت که افزایش غلظت هیپوکلریت تیامین (0/4 میلی گرم در لیتر به جای 0/1 میلی گرم در لیتر) فقدان ویتامین‌ها را به جز اینوزیتول جبران می‌کند. اینوزیتول یک کوفاکتور آنزیمی در چرخه گلیکولیز و TCA است و همچنین در متابولیسم اولیه و ثانویه گیاهان دخیل است.

محیط LS
محیط LS

محیط Gamborg یا (B5)

این محیط توسط O. L. Gamborg در سال 1968 توسعه یافت. او از محیط برای کشت کالوس و تعلیق سلولی Glycine max متعلق به خانواده Fabaceae استفاده کرد. این محیط ترکیبی از مواد مغذی مانند نمک‌های معدنی، ویتامین‌ها و کربوهیدرات‌ها است. غلظت نیترات و پتاسیم این محیط بیشتر است و آمونیاک کمتری دارد. نیترات پتاسیم در ایجاد تشکیل کالوس ریشه سویا مفید است و سولفات آمونیوم نقش اساسی در رشد سلول‌ها دارد. از این محیط به منظور کشت پروتوپلاست استفاده می‌شود.

محیط White’s

این محیط توسط P. R. White در سال 1963 برای ایجاد کشت ریشه‌ای گوجه فرنگی توسعه یافت. این اولین محیط کشت بافت گیاهی برای کشت ریشه بود. این محیط غلظت نمک کمتر و غلظت MgSO4 بالاتری دارد. غلظت نیترات آن 19 درصد کمتر از محیط کشت MS است. از این محیط می‌توان به منظور کشت ساقه و کشت کالوس استفاده کرد و برای گونه‌های Musa و Daucus مناسب است.

نحوه انتخاب محیط کشت گیاهی

این یک مرحله بسیار مهم در کشت بافت است، شما می‌توانید با سه محیط با غلظت‌های مختلف نمک، مانند غلظت نمک بالا، غلظت نمک متوسط ​​و غلظت نمک کم، کار را شروع کنید تا پاسخ مورد نظر را از کشت دریافت کنید. ترکیبی از نسبت‌های مختلف اکسین و سیتوکینین را می‌توان برای تکثیر ساقه یا تشکیل ساقه‌های اتفاقی استفاده کرد. علاوه بر این، طیف وسیعی از غلظت ساکارز ۶ تا ۲) را می‌توان برای ایجاد محیط کشت آزمایش کرد. یک آزمایش با طیف گسترده توسط De Fosard و همکاران توصیف شده است تا محیط مناسب برای کشت شما را ایجاد کند، به ویژه اگر سیستم آزمایش نشده باشد.

  • محیط را به چهار دسته کلی تقسیم کنید: (الف) مواد معدنی، (ب) اکسین‌ها، (ج) سیتوکینین‌ها و (د) مواد مغذی آلی (ساکاروز، آمینو اسیدها، اینوزیتول و غیره)
  • برای هر گروه از اجزاء، سه غلظت را انتخاب کنید: زیاد، متوسط ​​و کم.
  • ترکیب‌های مختلف چهار گروه از اجزاء را در سه غلظت مختلف امتحان کنید. این کار به آزمایش با 81 تیمار منجر می‌شود.
  • بهترین گزینه از 81 تیمار را با کد چهار حرفی مشخص کنید. به عنوان مثال، تیمار با نمک‌های متوسط، اکسین کم، سیتوکینین متوسط ​​و مواد مغذی آلی بالا به عنوان MLMH نشان داده می‌شود.
  • پس از رسیدن به این مرحله می‌توان غلظت‌های مختلف اکسین و سیتوکینین را برای تعیین غلظت مناسب تنظیم کننده‌های رشد آزمایش کرد.

معرفی فیلم آموزش یاخته شناسی و بافت شناسی گیاهی پیشرفته

فیلم آموزش یاخته شناسی گیاهی

امروزه نقش و اهمیت گیاهان در زندگی انسان‌ها بر کسی پوشیده نیست و استفاده از گیاهان در صنعت، کشاورزی، دارو و درمان و تغذیه، دامنه وسیعی را به خود اختصاص داده است. بنابراین شناخت گیاهان با توجه به نقشی که در سلامت انسان‌ها و محیط زیست ایفا می کنند، ضروری است. شناخت علوم گیاهی و درک چگونگی پیدایش، تکامل و سیستماتیک گیاهان بر مبنای شناخت صحیح و کامل از نحوه فعالیت سلول‌ها و بافت‌های گیاهی استوار هستند. این اطلاعات به دانشجویان کمک می‌کنند که در کنار تکمیل دانش خود درباره گیاهان، بتوانند به کمک سایر زمینه‌های علمی مانند ژنتیک و بیوتکنولوژی و کشت‌های آزمایشگاهی سلول‌ها و بافت‌های گیاهی، در جهت انجام پژوهش‌های مفید و ارزشمندی مانند اصلاح نباتات و توسعه تولیدات گیاهی گام بردارند.

مخاطبان این درس دانشجویان یا داوطلبان آزمون‌های ورودی رشته‌های زیست‌شناسی، زیست‌فناوری گیاهی، کشاورزی، فیزیولوژی گیاهی و علوم مرتبط هستند. این آموزش فرادرس، در دو بخش سلول‌شناسی و بافت‌شناسی پیشرفته، توسط دکتر زهرا زارع، عضو هیأت علمی گروه زیست‌شناسی دانشگاه فرهنگیان با استفاده از اشکال مناسب، با زبانی ساده و از سطح مقدماتی تا پیشرفته آموزش داده شده است.

  • برای مشاهده فیلم آموزش یاخته‌شناسی و بافت‌شناسی گیاهی پیشرفته + اینجا کلیک کنید.

انواع محیط کشت قارچ ها

دو نوع کلی محیط کشت برای اطمینان از بازیابی اولیه همه قارچ‌های بالینی قابل توجه از نمونه‌های بالینی ضروری است. یک محیط باید غیر انتخابی باشد مانند عصاره مغز و قلب آگار (Brain – Heart Infusion Agar) یا BHI آگار که به رشد تقریبا تمام قارچ‌های مرتبط با بالینی اجازه می‌دهد و سایر محیط‌ها باید انتخابی باشند و مخصوصاً برای جداسازی قارچ‌های بیماری‌زای مورد نظر خاص طراحی شوند. برای بازیابی بهینه پاتوژن قارچی، باید از باتری محیط استفاده شود و موارد زیر توصیه می‌شود:

  • محیط با یا بدون سیکلوهگزامید (سیکلوهگزیمید برای جلوگیری از رشد کپک‌های آلوده کننده با رشد سریع اضافه می‌شود.)
  • محیط‌های حاوی یا بدون عامل ضد باکتری (کلرامفنیکل، جنتامایسین و سیپروفلوکساسین معمولاً برای این منظور از ضد باکتری استفاده می‌شود).

از عوامل ضد باکتریایی برای از بین بردن گونه‌های آلوده باکتری استفاده می‌شود. اگر نمونه از محل استریل گرفته شده باشد، نیازی به استفاده از محیط حاوی عوامل ضد باکتری نیست. در ادامه انواع محیط های کشت قارچی و کاربردهای هر کدام را بررسی کرده ایم.

محیط های کشت قارچی
در این تصویر انواع قارچ‌های مختلف روی محیط خاص خود کشت داده شده اند.

محیط آگار دانه پرنده

محیط کشت «آگار دانه پرنده» (Bird seed agar) حاوی دانه‌های Guizotia abyssinica، گلوکز، کراتینین، کلرامفنیکل، فسفات منو پتاسیم، آگار است و در جداسازی انتخابی و افتراقی «کریپتوکوکوس نئوفورمیس» (Cryptococcus neoformans) از نمونه‌های بالینی کاربرد دارد.

محیط عصاره مغز و قلب آگار

این محیط حاوی عصاره قلبی – مغزی، گلوکز، L – سیستئین هیدروکلراید و آگار است. این یک محیط کشت قارچی غیر انتخابی است که امکان رشد تقریباً همه قارچ‌های مرتبط با موارد بالینی را می‌دهد. برای بازیابی اولیه قارچ‌های ساپروفیت و دیمورف و رشد قارچ‌های بیماری‌زای سریع مانند «هیستوپلاسما کپسولاتوم» (Histoplasma capsulatum) و «بلاستومیسز درماتیدیس» (Blastomyces dermatitidis) استفاده می‌شود.

محیط CHROMagar Candida

این محیط حاوی پپتون، گلوکز، کلرامفنیکل، Chromogenic ix و آگار بوده و در محیط کروموژنیک انتخابی و افتراقی برای جداسازی و شناسایی گونه‌های مختلف کاندیدا کاربرد دارد.

محیط آرد ذرت

محیط کشت آرد ذرت یا آرد ذرت تویین آگار از آرد ذرت، تویین 80 و آگار ساخته شده است. این محیط در شناسایی C. albicans با مورفولوژی میکروسکوپی یا تولید کلامیدوسپور کاربرد دارد.

محیط Czapek-Dox اگار

Czapek dox agar یک محیط نیمه سنتتیک است که حاوی نیترات سدیم به عنوان تنها منبع نیتروژن است. از این محیط برای تلقیح گونه‌های آسپرژیلوس برای تشخیص افتراقی آن‌ها استفاده می‌شود. این محیط حاوی NaNO3 ، K2HO4 ، KCl ، MgSO4 ، FeSO4، گلوکز و آگار بوده و در شناسایی گونه‌های «آسپرژیلوس» (Aspergillus) و «پنیسیلیوم» (Penicillium) کاربرد دارد. همچنین می‌تواند برای تولید کلامیدوسپور توسط کاندیدا آلبیکنز استفاده شود.

محیط Czapek-Dox اگار

محیط درماتوفیت تست (DTM)

این محیط حاوی پپتون سویا، دکستروز، سیکلو هگزامید، کلرامفنیکل، جنتامایسین سولفات، فنل قرمز و آگار است. این محیط برای کشت قارچی اولیه و افتراقی برای جداسازی و شناسایی درماتوفیت‌ها مناسب است.

محیط مهارکننده کپک آگار (IMA)

آگار کپک مهاری (IMA) یک محیط غنی شده حاوی کلرامفنیکل (با برخی فرمولاسیون‌های حاوی جنتامایسین) است. این محیط حاوی موادی مانند تریپتون، عصاره گوشت گاو، عصاره مخمر، نشاسته، دکسترین، کلرامفنیکل، جنتامایسین و سالین بافر است و از رشد طیف وسیعی از قارچ‌ها پشتیبانی می‌کند. همچنین به دلیل محتوای آنتی بیوتیکی که دارد، ممکن است مانع از رشد باکتری‌ها شود. از آن برای بازیابی اولیه قارچ‌های بیماری زای دیمورف استفاده می‌شود. قارچ‌های ساپروفیت و درماتوفیت‌ها با استفاده از آن بازیابی نمی‌شوند.

محیط Mycosel/mycobiotic آگار

این محیط حاوی پاپاییک هضم شده کنجاله سویا، دکستروز، سیکلوهگزامید، کلرامفنیکل و آگار است. به طور کلی در این محیط دکستروز آگار سابورو با سیکلو هگزیمید و کلرامفنیکول اضافه شده است و به طور کلی برای بازیابی اولیه درماتوفیت‌ها استفاده می‌شود. این محیط بسیار انتخابی بوده و برای جداسازی قارچ‌های بیماری‌زا از مواد حاوی مقدار زیادی فلور قارچی و باکتریایی کاربرد دارد.

محیط سیب زمینی دکستروز آگار

سیب زمینی دکستروز آگار (PDA) یک محیط معمولی رشد قارچی است که از تزریق سیب زمینی و دکستروز تهیه می‌شود. می‌توان آن را با اسید یا آنتی بیوتیک تکمیل کرد تا از رشد باکتری جلوگیری کند. این محیط حاوی عصاره سیب زمینی، خیسانده سیب زمینی، دکستروز و آگار است که محیط ایده آل برای آماده سازی کشت اسلاید بوده و باعث اسپورزایی درماتوفیت‌ها و نمایش تولید رنگدانه توسط T. rubrum می‌شود. این محیط برای شمارش در آزمایش میکروبی مواد غذایی، محصولات لبنی و لوازم آرایشی توصیه می‌شود.

محیط PDA
در این تصویر محیط PDA نشان داده شده است.

محیط آگار پوسته سیب زمینی

این محیط حاوی تکه‌های سیب زمینی، دکستروز و آگار است و در بازیابی اولیه قارچ‌های ساپروفیت و بیماری‌زا به ویژه سویه‌های با رشد سریع و آهسته استفاده می‌شود.

محیط نشاسته برنج آگار

این محیط حاوی خمیر برنج، تویین 80 و آگار بوده که در تولید کلامیدوسپور در کاندیدا آلبیکنز استفاده می‌شود.

محیط سابورو دکستروز آگار

این محیط حاوی کازئین هضم شده پانکراتیک، گلوکز و آگار بوده و در رشد و نگه‌داری عوامل بیماری زای مهم قارچی کاربرد دارد. آگار سابورود برای بازیابی درماتوفیت‌ها از نمونه‌های پوستی و مخمرهای کشت تناسلی مناسب است. به عنوان یک محیط کشت جداسازی اولیه توصیه نمی‌شود زیرا برای بازیابی برخی گونه‌های بیماری‌زای سرسخت، به ویژه اکثر قارچ‌های دیمورفیک، غنی نیست. دکستروز آگار سابورو ۲ درصد به عنوان محیطی برای تلقیح قارچ‌های بازیابی شده در محیط غنی شده برای افزایش اسپورزایی معمولی و ارائه مورفولوژی مشخصه کلونی مفیدتر است.

محیط کشت جلبک

جلبک‌ها در زیستگاه‌های طبیعی خود همه مواد مغذی، مواد معدنی و ویتامین‌های مورد نیاز خود را از آبی که در آن زندگی می‌کنند بدست می‌آورند با این حال، برای رشد آن‌ها در آزمایشگاه، باید همه این منابع ضروری را در اختیار آن‌ها قرار دهید، یعنی شما باید برخی از محیط‌های رشد را تشکیل دهید. محیط‌های جلبکی به محلول یا مجیطی که در آن جلبک‌ها رشد می‌کنند اشاره دارد. همه محیط‌ها دارای چندین جزء مشترک هستند: منابع نیتروژن (از نیترات، نیتریت و آمونیاک)، فسفر، ویتامین‌ها و فلزات کمیاب. با این حال در میان انواع خاصی از این مواد مغذی، غلظت و نسبت آن‌ها بین محیط متفاوت است.

محیط کشت جلبک
از انواع محیط های کشت جامد (پلیت آگار) و مایع (سالت براث) برای کشت و تکثیر و خالص سازی جلبک‌ها در آزمایشگاه استفاده می‌شود.

کشت جلبک‌ها به کود یا مواد مغذی نیاز دارد. برای رشد جلبک‌ها در نظر بگیرید که آن‌ها از طریق غشای سلولی خود با محیط خود در تماس هستند. آن‌ها با ترکیب فیزیکی، شیمیایی و بیولوژیکی آب تعامل دارند. وقتی سلول‌های جلبک را کشت می‌دهیم سعی می‌کنیم این عوامل را کنترل کرده و رشد سلول‌های مورد نظر خود را هدف قرار دهیم. انواع مختلفی از آب وجود دارد که برای کشت جلبک استفاده می‌شود که شامل موارد زیر هستند.

  • آب شیرین (کلرلا)
  • آب دریا (Nannochloropsis ، Pyrocystis fusiformis ، Porphyridium ، Isochrysis)
  • قلیایی (Arthrospira یا اسپیرولینا)

محیط کشت جلبکی از هر دو عامل نمک‌ها و مواد مغذی تشکیل شده است. غلظت نمک آب شیرین بسیار کم است، مقدار کمی بافر کربن به محیط اضافه کنیم (pH 7) آب دریا تا حد زیادی حاوی کلرید سدیم (pH 8/2) است. نمک‌های قلیایی شامل کربنات سدیم و بی کربنات سدیم (pH 10) هستند. انواع نمک‌های مختلف محیط های کشت جلبک‌ها را تشکیل می‌دهند که شامل NaHCO3، Na2CO3، K2HPO4، NaNO3، K2SO4، NaCl، MgSO4 7(H2O) و CaCl2 2(H2O) هستند که با توجه به سویه مورد نظر خود دستور العمل ساخت محیط بهینه را لازم است که از مقالات استخراج کنید. به عنوان مثال محیط کشت F2 ترکیبی کامل از همه مواد مغذی و چیزهایی است که یک کشت مانند جلبک اسپیرولینا به آن نیاز دارد. این نوع محیط رایج ترین و پرکاربردترین محیط کشت طراحی شده برای رشد جلبک‌های دریایی مورد استفاده در مطالعات زیست شناسی و آبزی پروری محیط عمومی غنی سازی آب دریا است. محتوای مواد مغذی مورد نیاز جلبک را می‌توان در دو گروه اصلی شرح داد:

  • درشت مغذی‌ها: نیتروژن، فسفر
  • ریز مغذی‌ها: فلزات کمیاب، ویتامین‌ها

این مواد مغذی می‌توانند در محیط جامد، مایع یا نیمه جامد به نام محیط رشد وجود داشته باشند. هر دو فاز را می‌توان برای حمایت از رشد سلول‌های میکرو جلبک استفاده کرد، اما هر نوع محیط برای اهداف مختلف رشد مورد استفاده قرار می‌گیرد. سالت براث و پلیت آگار دو نوع اصلی محیط رشد هستند که برای کشت سلول جلبک استفاده می‌شوند. به طور معمول، کشت‌ها در سالت براث مایع با مواد مغذی مربوطه رشد می‌کنند و در شرایط مطلوب نگه‌داری می‌شوند. با این حال، اگر می‌خواهید کشت‌ها را برای مدت طولانی تری با نگه‌داری کمتر بین نقل و انتقالات نگه دارید، یا می‌خواهید در صورت خراب شدن کشت‌های مایع کشت مجدد تهیه کنید، بهتر است که همیشه کشت‌های پشتیبان روی پلیت آگار تهیه کنید.

معرفی فیلم آموزش میکروبیولوژی صنعتی

آموزش میکروبیولوژی صنعتی

امروزه با حرکت رو به رشد و سریع تکنولوژی، نیاز بشر به دانستن اطلاعات مکفی از علوم شناور و بین رشته‌ای، روز به روز محسوس‌تر می‌شود. با توجه به پیشرفت علم زیست فناوری یا بیوتکنولوژی و استفاده از آن، در جهت رفع نیاز صنایع عظیم جهانی و در جهت تولید نسل جدید داروها، زمینه کاری و پژوهشی بسیار مناسبی در این بستر به وجود آمده است که برای ورود به آن عرصه، یک بیوتکنولوژیست یا زیست شناس نیاز دارد تا بر اصول و طراحی فرایندهای بیولوژیک از جمله طراحی و استفاده از انواع محیط های کشت احاطه داشته باشد.

فرادرس که توسط آقای آرش وکیلی، دانشجوی سال آخر کارشناسی ارشد مهندسی شیمی – بیوتکنولوژی دانشگاه تربیت مدرس تدریس و به کمک تیم فرادرس آماده سازی و تدوین شده است. این آموزش شامل هشت فصل مختلف بوده که در آن مباحثی مانند تهیه محیط کشت، سترون سازی، مایه تلقیح و سینتیک رشد میکروبی گنجانده شده اند. این آموزش برای دانشجویان گرایش‌های مختلف زیست شناسی و مهندسی پزشکی، مهندسی شیمی، شیمی، پزشکی و میکروبیولوژی مناسب است.

اگر بازخوردی درباره این مطلب دارید یا پرسشی دارید که بدون پاسخ مانده است، آن را از طریق بخش نظرات مطرح کنید.

اگر این مطلب برای شما مفید بوده است، آموزش‌ها و مطالب زیر نیز به شما پیشنهاد می‌شوند:

«نسیم حسینی» فارغ التحصیل مقطع کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی از پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک است، فعالیت علمی و کاری وی در زمینه ژنتیک مولکولی و بهبود عملکرد پروتئین‌های آنزیمی بوده است. او مطالب آموزشی و تخصصی مجله فرادرس را در حوزه‌های زیست شناسی و بالینی می‌نویسد.

بر اساس رای 10 نفر

آیا این مطلب برای شما مفید بود؟

نظر شما چیست؟

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *