cDNA چیست؟ – توضیح به زبان ساده

cDNA چیست؟

«DNA مکمل» (Complementary DNA | cDNA) نوعی مولکول DNA است که از روی یک رشته RNA به وسیله آنزیم «رونویسی معکوس» (Reverse Transcriptase) ساخته می‌شود و به این فرآیند ساخته شدن cDNA نیز «رونویسی معکوس» (Reverse Transcription) می‌گوییم.

چرا به سنتز cDNA از روی mRNA نیاز داریم؟

برای مطالعه توالی کدکننده یک ژن باید به mRNA دسترسی داشته باشیم، زیرا در mRNA نواحی غیرکدکننده حذف شده‌اند و تنها ناحیه‌ای که کدکننده پروتئین است وجود دارد، اما مطالعه mRNA  با توجه به ماهیت ناپایدار آن دشوار است و ساخت cDNA که مانند DNA ژنومی از دو رشته تشکیل شده است، به ما کمک می‌کند تا به مولکولی با ماهیتی پایدار دسترسی داشته باشیم و نگران تجزیه mRNA توسط آنزیم‌های تجزیه‌کننده RNA نباشیم.

یادگیری ژنتیک با فرادرس

فرادرس با توجه به گستردگی دنیای ژنتیک، فیلم‌های آموزشی متنوعی را تولید و منتشر کرده است که با استفاده از آن‌ها می‌توان مسیر یادگیری را سریع‌تر پیمود. در ادامه تعدادی لینک دسترسی به تعدادی از آن‌ها را در اختیار شما قرار می‌دهیم.

• فیلم آموزش جامع مبانی علم ژنتیک فرادرس
• فیلم آموزش شبیه سازی روند کلونینگ و PCR با نرم افزار اسنپ ژن SnapGene فرادرس
• فیلم آموزش جامع مهندسی ژنتیک فرادرس
• فیلم آموزش واکنش زنجیره ای پلیمراز PCR و طراحی پرایمر فرادرس

کاربرد cDNA چیست؟

حالا که یاد گرفتیم cDNA چیست، زمان آن رسیده است که به کاربردهای آن بپردازیم. DNA مکمل به طور معمول در ایجاد کلون از ژن‌ها به کار گرفته می‌شود یا به عنوان نشانگر ژنی استفاده می‌شود. برای تولید کتابخانه‌های cDNA نیز از این مولکول استفاده می‌شود.

فیلم آموزش PCR و طراحی‌ پرایمر در فرادرس

کلیک کنید

گاهی در مطالعات تحقیقاتی، هدف پژوهشگران تولید پروتئين از روی اطلاعات ژنتیکی خاصی است، به همین دلیل آن‌ها باید اطلاعات ژنتیکی را از سلولی به سلول دیگری منتقل کنند، در این شرایط از cDNA استفاده می‌شود، زیرا این مولکول فاقد نواحی غیرکدکننده است و با بیان آن می‌توان بدون نگرانی برای روند بلوغ mRNA و جداسازی نواحی غیرکدکننده به پروتئین حاصل از بیان ژن دسترسی پیدا کرد.

«واکنش زنجیره‌ای پلیمراز» (Polymerase Chain Reaction | PCR) روشی برای افزایش تعداد نسخه‌هایی است که از یک توالی DNA داریم. یکی از واکنش‌هایی که در مراحل ابتدایی PCR انجام می‌شود،‌ رونویسی معکوس با هدف تولید cDNA است و پس از تشکیل cDNA سلسله واکنش‌های PCR آغاز می‌شوند.

از cDNA برای مطالعه بیان ژن‌ها از طریق روش‌های زیر نیز استفاده می شود.

• توالی‌یابی RNA
• «واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بی‌درنگ» (Real-Time Polymerase Chain Reaction |RT-PCR)

پروتکل سنتز cDNA

• روش «فنل-کلروفرم» (Phenol-Chloroform)
• روش «سیلیکاژل» (Silica Column)

انتخاب روش استخراج RNA به منبع سلولی بستگی دارد، به عنوان مثال در صورتی که قصد جداسازی RNA از سلول گیاهی را داشته باشیم به ترکیباتی مانند پلی‌وینیل‌پیرولیدون برای حذف ترکیباتی که RNA را غیرقابل استفاده می‌کند، نیاز داریم. از جمله‌ این ترکیبات می‌توان به ترکیبات فنولی و کربوهیدرات‌ها اشاره کرد.

DNA و پروتئین‌ها نیز باید از محلولی که حاوی RNA است، حذف شوند، بنابراین از آنزیم‌هایی مانند DNase و پروتئیناز K استفاده می‌کنیم. مسئله دیگری که در حین استخراج RNA باید به آن توجه نشان داد، حفظ ساختار مولکول RNA است، به این منظور باید آنزیم‌های تجزیه کننده RNA  حذف شوند که برای این کار از ترکیباتی که در ادامه نام می‌بریم استفاده می‌شود.

• ایزوتیوسیانات گوانیدینیوم
• «سدیم دودسیل سولفات» (SDS)
• فنل
• کلروفرم

پس از آن که RNA از ترکیبات دیگر سلول به طور کامل جدا شد، از الکل استفاده می‌کنیم تا RNA رسوب کند و سپس به سراغ فرآیند رونویسی معکوس می‌رویم که دارای دو مرحله زیر است.

• سنتز رشته اول
• سنتز رشته دوم

سنتز رشته اول

سنتز رشته دوم

پس از آن که رشته اول ساخته شد، هیبرید RNA-DNA می‌تواند دو سرنوشت متفاوت داشته باشد.

• رشته دوم سنتز شود.
• به همان شکل در آزمایش‌های پایین‌دست مورد استفاده قرار بگیرد.

یک روش ابتدایی که برای سنتز رشته دوم وجود دارد بر اساس ساختار سنجاق‌سری استوار است. در این روش در انتهای '۳ رشته اول cDNA با هدف تحریک سنتز رشته دوم ساختار سنجاق‌سری ایجاد می‌شود؛ اما این فرآیند اتفاقی تصادفی است. ممکن است هیدرولیز حلقه ایجاد شده منجر به از دست رفتن بخشی از اطلاعات شود. در روش بهینه‌شده‌ای که دانشمندان ساخته‌اند، از آنزیم RNase H برای جداسازی mRNA از رشته اول cDNA استفاده می‌شود. در گام بعد DNA پلیمراز یک به رشته متصل شده و رشته دوم را می‌سازد.

جمع‌بندی

در این مطلب از مجله فرادرس یاد گرفتیم که cDNA چیست و چطور توسط آنزیم رونویسی معکوس از روی رشته RNA ساخته می‌شود. به طور کلی ویروس‌ها برای آن که بتوانند اطلاعات ژنتیکی خود را که به طور معمول به شکل RNA موجود است در DNA سلول میزبان ادغام کنند، از آنزیم رونویسی معکوس استفاده می‌کنند و cDNA را می‌سازند، اما پژوهشگران از این آنزیم برای دستیابی به اهداف دیگری از قبیل ساخت کتابخانه cDNA یا به پیش بردن روند PCR استفاده می‌کنند.