آزمایش مزلسون استال – به زبان ساده + توضیح و تصویر

آزمایش مزلسون استال، آزمایشی است که توسط دو دانشمند برای اثبات فرضیه واتسون و کریک در مورد نیمه‌حفاظتی بودن همانندسازی DNA در سال ۱۹۵۸ انجام شد. در این مطلب از مجله فرادرس با روند آزمایش مزلسون استال و نتایج آن آشنا می‌شویم، اما پیش از آن به معرفی نظریه‌های متفاوتی می‌پردازیم که راجع به همانندسازی ‌DNA مطرح شده بودند.

آزمایش مزلسون استال

یک‌ سال پس از آن که واتسون و کریک مقاله خود راجع به ساختار DNA (دنا) را منتشر کردند، دو دانشمند به نام «مت مزلسون» و «فرانکلین استال» تصمیم به بررسی روند همانندسازی دنا گرفتند. این دو برای روند آزمایش خود از باکتری «اشرشیا کلی» ( E. coli) به عنوان مدل آزمایشگاهی استفاده کردند.

هدف آزمایش مزلسون استال

واتسون و کریک نظریه‌ای راجع به همانندسازی DNA مطرح کرده بودند که در آن نظریه گفته شده بود که همانندسازی دنا به صورت نیمه‌حفاظت شده است. مزلسون و استال با طراحی آزمایش قصد اثبات یا رد این فرضیه را داشتند، در نهایت نیز موفق به ثبت شواهدی شدند که نشان می‌داد DNA به صورت نیمه‌حفاظت شده تکثیر می‌شود.

فیلم آموزش زیست شناسی – پایه دوازدهم رشته تجربی – بخش یکم در فرادرس

کلیک کنید

روش‌های همانندسازی ‌DNA

پس از کشف ساختار DNA، سه روش برای همانندسازی دنا توسط جامع علمی مطرح شد که در ادامه با این سه مدل آشنا می‌شویم.

• «همانندسازی نیمه‌حفاظت‌ شده» (Semi-Conservative Replication): در این نوع همانندسازی، دو رشته DNA از یکدیگر باز می‌شوند و هر کدام به عنوان الگویی برای ساخت رشته جدید استفاده می‌شود. به این ترتیب رشته جدید مکمل رشته الگو خواهد بود. نتیجه این مدل همانندسازی دو مولکول DNA است که هر یک دارای یک رشته از دنای اولیه و یک رشته جدید هستند.
• «همانندسازی حفاظت شده»(Conservative Replication): در این روش همانندسازی ۲ مولکول دنا خواهیم داشت که یکی از آن‌ها دارای دو رشته تازه سنتز شده و دیگری دارای دو رشته اصلی است. یعنی در طی فرآیند همانندسازی دو رشته DNA از یکدیگر باز می‌شوند و رشته‌های جدید سنتز می‌شوند اما پس از پایان همانندسازی دو رشته جدید با یکدیگر جفت شده و رشته‌های اصلی دوباره به یکدیگر متصل می‌شوند.
• «همانندسازی غیرمحافظتی» (Dispersive Replication): نتیجه همانندسازی غیرمحافظتی دو مولکول DNA است که مخلوطی از رشته‌های اصلی و تازه ساخته شده (رشته‌های مادری و دختری) هستند. البته باید توجه داشت که در توالی دنا تغییر ایجاد نمی‌شود و توالی DNA مشابه رشته‌های اصلی است.

همانندسازی DNA فرآیندی پیچیده است که جزئیات منحصر به فرد خودش را دارد. در صورتی که تمایل دارید راجع به روند همانندسازی اطلاعات کامل‌تری به دست آورید، مطالعه مطلب «همانند سازی DNA — به زبان ساده» از مجله فرادرس را به شما توصیه می‌کنیم.

بین این سه فرضیه، روش همانندسازی نیمه حفاظت شده توجه محققان بیشتری را جلب کرد، بنابراین تحقیقات زیادی به اثبات این روش اختصاص یافت. این روش با بسیاری از ویژگی‌های DNA  از قبیل مکمل بودن جفت‌ بازهایی که روبه‌روی هم قرار می‌گیرند،‌ همخوانی داشت. یکی از گروه‌هایی که در این زمینه شروع به تحقیق کردند مزلسون و استال بودند که توانستند به نتایج دقیقی برسند.

فرآیند آزمایش مزلسون استال

مزلسون و استال برای آزمایش معروف خود از باکتری اشرشیا کلای استفاده کردند تا بتوانند روند همانندسازی DNA را شناسایی کنند. در این آزمایش از $$^{15}\text{N}$$ استفاده شد که یکی از ایزوتوپ‌های سنگین و غیررادیواکتیو نیتروژن است.

این دو دانشمند برای استفاده از این ایزوتوپ نیتروژن در آزمایشی که طراحی کردند، دلیلی محکم داشتند. نیتروژن یکی از اصلی‌ترین عناصر موجود در ساختار DNA است و ایزوتوپ $$^{14}\text{N}$$ فراوان‌ترین نوع نیتروژن موجود در طبیعت است، در حالی که $$^{15}\text{N}$$ ایزوتوپ سنگین‌تری است که اگر در DNA حضور داشته باشد مانع فعالیت دنا نمی‌شود. بنابراین مزلسون و استال «ای. کولی» (E. coli) را در محیط کشتی که حاوی $$NH_4Cl$$ بود، کشت دادند. نیتروژن موجود در $$NH_4Cl$$ از نوع $$^{15}\text{N}$$ است.

برای درک بهتر فرآیند این آزمایش نیاز است که تا حدی به مبانی و مفاهیم مقدماتی زیست‌شناسی سلولی و مولکولی مسلط باشیم. در صورتی که به این منظور دنبال کسب اطلاعات کامل‌تر هستید، فیلم آموزش «زیست شناسی سلولی و مولکولی – مبانی و مفاهیم مقدماتی» از فرادرس را به شما پیشنهاد می‌دهیم.

فیلم آموزش زیست شناسی سلولی و مولکولی – مبانی و مفاهیم مقدماتی در فرادرس

کلیک کنید

باکتری زمانی که در این محیط کشت قرار بگیرد، شروع به جذب و استفاده از $$^{15}\text{N}$$ برای ساخت مولکول‌های زیستی، ازجمله DNA می‌کند. در آزمایش مزلسون و استال چند نسل همانندسازی باکتری‌ها در محیط کشت $$^{15}\text{N}$$ انجام شد، بنابراین قابل انتظار بود که نیتروژن موجود در دنای باکتریایی به طور کامل از نوع $$^{15}\text{N}$$ باشد.

در مرحله بعد، این باکتری‌ها را از محیط کشت $$^{15}\text{N}$$ خارج شده و در محیط کشت $$^{14}\text{N}$$ برای چند نسل کشت داده شدند. با توجه به این که تنها نوع نیتروژن موجود در محیط کشت دوم $$^{14}\text{N}$$ بود، باکتری‌ها پس از چند نسل همانندسازی، در ساختار دنای خود باید دارای $$^{14}\text{N}$$ باشند.

مزلسون و استال اطلاعات کافی راجع به بازه زمانی مورد نیاز باکتری برای همانندسازی و تولیدمثل باکتریایی را داشتند، بنابراین نمونه‌های کوچکی از هر نسل باکتریایی جدا و در گام بعد، ‌DNA باکتری‌ها را استخراج و خالص می‌کردند. مرحله بعد سنجش چگالی DNA استخراج شده بود، در حقیقت در این مرحله به صورت غیرمستقیم محتوای $$^{14}\text{N}$$ و $$^{15}\text{N}$$ را اندازه می‌گرفتند. برای این کار از «سانتریفیوژ گرادیانت چگالی» (Density Gradient Centrifugation) استفاده کردند.

سانتریفیوژ گرادیانت چگالی قادر به جداسازی مولکول‌هایی مانند DNA در حضور مولکول دیگری مانند سزیم کلرید، در سرعت بالا است. در این شرایط مولکول‌ها بر اساس چگالی متفاوتی که دارند از یکدیگر جدا شده و شیب چگالی ایجاد می‌شود. شیب چگالی به این صورت است که مولکول‌هایی با چگالی کمتر روی محلول و مولکول‌هایی با چگالی بیشتر به ترتیب در پایین محلول موجود در لوله آزمایش قرار می‌گیرند. مزیت استفاده از این سانتریفیوژ در قدرت جداسازی مولکول‌هایی نهفته است که تفاوت چگالی کمی دارند. در تصویر فوق می‌بینید که DNA حاوی $$^{14}\text{N}$$ با وجود تفاوت چگالی اندک با DNA داری $$^{15}\text{N}$$، در قسمت بالایی لوله آزمایش قرار گرفته است.

مواد و تجهیزات لازم برای آزمایش مزلسون استال

با توجه به توضیحاتی که داده شد می‌توان گفت که در این آزمایش از مواد و تجهیزات زیر برای بررسی روش همانندسازی DNA استفاده شد.

• سانتریفیوژ (۶۰ هزار دور در دقیقه): سانتریفیوژ دستگاهی است که از نیروی گریز از مرکز، نمونه را تحت تاثیر یک نیروی ثابت قرار می‌دهد. با استفاده از سانتریفیوژ می‌توان اجزای یک محلول را از یکدیگر جدا کرد.
• باکتری اشرشیا کلای: نوعی باکتری گرم منفی که به سادگی و بدون هزینه زیاد در آزمایشگاه کشت داده می‌شود و مورد استفاده‌ترین مدل پروکاریوتی در تحقیقات مختلف بوده است.
• $$NH_4Cl$$: یک ماده شیمیایی معدنی که با نام «آمونیوم کلرید» شناخته می‌شود.
• سزیم کلرید: یک ماده شیمیایی معدنی با فرمول شیمیایی $$CsCl$$ که ظاهری پودری و سفید رنگ دارد.

چرا باید DNA را نشانه‌گذاری می‌کردند؟

برای تشخیص روند همانندسازی DNA در هر نسل و تفاوت مولکول‌های یک نسل با نسل بعدی نیاز بود که این مولکول‌ها نشانه‌گذاری شوند. با توجه به تفاوت جرم مولکول DNA دارای ایزوتوپ $$^{14}\text{N}$$ و مولکول DNA دارای ایزوتوپ $$^{15}\text{N}$$ می‌توان از تفاوت چگالی مولکول‌ها برای تشخیص تفاوت‌های آن‌ها استفاده کرد. به همین منظور باکتری‌ها را ابتدا در محیط کشت غنی از $$^{15}\text{N}$$ کشت دادند و پس از جدا کردن مقداری نمونه، محیط کشت را عوض کرده و ایزوتوپ $$^{14}\text{N}$$ را در اختیار باکتری‌ها قرار دادند.

یادگیری زیست شناسی سلولی و مولکولی با فرادرس

با کشف ساختار DNA توسط واتسون و کریک، سرعت پیشرفت علوم مولکولی در دنیای زیست شناسی چند برابر شد و شاخه‌هایی مانند ژنتیک مولکولی پا به عرصه ظهور گذاشتند. از سویی دیگر ژن‌هایی که روی مولکول‌های DNA قرار دارند تمام فعالیت‌های سلول را کنترل می‌کنند، بنابراین شناخت هرچه بیشتر توالی DNA روز به روز مهم‌تر به نظر می‌رسد.

برای یادگیری مباحث پیشرفته و پیچیده‌ای مانند ژنتیک مولکولی، ژنتیک جمعیت و طراحی پروتئين‌های نوترکیب در وهله اول باید با ساختار مولکول‌های DNA، انواع RNA و نحوه فعالیت‌های آن‌ها آشنا شد. فرادرس دوره‌های متنوعی تولید و منتشر کرده است که این موضوعات را از پایه شروع می‌کنند و با استفاده از آن‌ها می‌توان اطلاعات کاملی در زیست‌شناسی سلولی و مولکولی و حتی مهندسی پزشکی به دست آورد. در ادامه تعدادی از این دوره ها را به شما معرفی می‌کنیم.

• فیلم آموزش بخش یکم زیست شناسی  پایه دوازدهم رشته تجربی فرادرس
• فیلم آموزش بخش دوم زیست شناسی پایه دوازدهم فرادرس
• فیلم آموزش جامع و با مفاهیم کلیدی ژنتیک مولکولی فرادرس
• فیلم آموزش آموزش ژنتیک مولکولی انسان همراه با مفاهیم کلیدی فرادرس
• فیلم آموزش زیست شناسی مولکولی پیشرفته فرادرس

در صورتی که تمایل دارید اطلاعات خود در مباحث مختلف علم زیست‌شناسی را افزایش دهید، به شما بازدید از صفحه مجموعه فیلم‌های آموزش زیست شناسی فرادرس را پیشنهاد می‌کنیم.

• مجموعه فیلم ‌های آموزش زیست شناسی فرادرس

نتایج آزمایش مزلسون استال

با بررسی DNA چهار نسل اول باکتری E. coli، الگویی به کمک شیب غلظت‌های به دست آمده، شکل گرفت که در تصویر زیر می‌توانید جزئیات آن را ببینید.

برای آن‌ که بهتر متوجه شویم که مزلسون و استال از این نتایج چه برداشتی کردند، در ادامه نسل‌های مختلف باکتریایی را بررسی می‌کنیم تا متوجه شویم که در باکتری‌ها چه اتفاقاتی رخ داده‌اند.

نسل ۰

DNA استخراج شده از سلول‌ها رشد کرده در محیط کشت حاوی $$^{15}\text{N}$$ فقط یک باند تشکیل داد که نشان‌دهنده‌ این است که کل مولکول دنا دارای ایزوتوپ نیتروژن-۱۵ است. جداسازی این باکتری‌ها قبل از انتقال به محیط کشت سبک‌ (حاوی $$^{14}\text{N}$$) صورت گرفته است.

نسل ۱

پس از یک دور همانندسازی DNA در محیط کشت جدید، استخراج و سانتریفیوژ DNA انجام شد. در نتایج سانتریفیوژ، یک باند مشاهده شد اما یک تفاوت با تک باند نسل ۰ داشت. باند نسل ۱ چگالی کمتری نسبت به نسل ۰ داشت و دلیل این امر را می‌توان وجود رشته‌های DNA دانست که در ساختار خود $$^{14}\text{N}$$ دارند اما تعدادشان به اندازه‌ای نیست که بتوانند باند جداگانه‌ای را به خود اختصاص بدهند.

باند نسل ۱ که به آن «باند میانه» نیز می‌گوییم، باعث شد که مزلسون و استال نتیجه‌ بگیرند که DNA ساخته شده در این همانندسازی ترکیبی از رشته‌های سبک و سنگین است، منظور از رشته سبک، DNA حاوی $$^{14}\text{N}$$ و رشته سنگین، DNA حاوی $$^{15}\text{N}$$ است. این حالت با همانندسازی نیمه‌حفاظت شده و همانندسازی غیرحفاظتی هم‌خوانی دارد و اگر همانندسازی DNA به صورت حفاظت شده بود، در همین مرحله نیز ۲ باند جدا مشاهده می‌شد.

نسل ۲

اطلاعاتی که از بررسی نسل دوم به دست آمد به مزالسون و استال کمک کرد که راجع به نیمه‌حفاظت شده یا غیرحفاظتی بودن همانندسازی DNA تصمیم بگیرند.

زمانی که DNA استخراج شده از باکتری‌های نسل دوم سانتریفیوژ شدند، ۲ باند تشکیل شد. یکی از این باند‌ها در محل باند میانه مشاهده شد که در نسل ۱ نیز تشکیل شده بود. اما باند دوم در ارتفاع بیشتری مشاهده شده بود که مربوط به مولکول‌های DNA بود که فقط دارای $$^{14}\text{N}$$ بودند.

فیلم آموزش تقسیم سلولی، چرخه سلولی، میتوز و میوز در زیست شناسی (رایگان) در فرادرس

کلیک کنید

نتیجه این مرحله به مزلسون و استال ثابت کرد که همانندسازی DNA به صورت نیمه‌حفاظت شده است زیرا تشکیل یک باند در ناحیه سبک و یک باند در ناحیه میانه، فقط می‌تواند با روش نیمه‌حفاظت شده مرتبط باشد. اگر روش همانندسازی به صورت غیرحفاظتی بود، DNA ساخته شده در هر نسل باید شامل هر دو بخش DNA ساخته شده با $$^{15}\text{N}$$ و تشکیل شده از $$^{15}\text{N}$$ می‌بود، چنین مولکولی نمی‌توانست باندی در ناحیه سبک ایجاد کند.

در تصویر زیر می‌توانید ببینید که باند نارنجی ایجاد شده در نسل دوم مربوط به مولکول‌های DNA است که هر دو رشته‌ آن‌ها با $$^{14}\text{N}$$ ساخته شده‌اند.

نسل‌های ۳ و ۴

در روش نیمه‌حفاظت شده، انتظار می‌رود که در نسل سوم، هر مولکول DNA هیبرید (یک رشته دارای $$^{14}\text{N}$$ و رشته مقابل حاوی $$^{15}\text{N}$$) نسل دو، یک مولکول DNA هیبرید و یک مولکول DNA سبک ایجاد کند. از مولکول‌های DNA سبک نسل دو نیز تنها انتظار تولید DNAهای سبک می‌رود. با این توضیحات پیش‌بینی مناسب برای نسل ۳ و ۴، باریک شدن باند میانه و واضح‌تر شدن باند سبک است.

در آزمایش مزلسون استال نسل ۳ و ۴ نتایجی مطابق با روش نیمه‌حفاطت شده نشان دادند، به این ترتیب اثبات شد که همانندسازی یک مولکول دنا به صورت نیمه‌حفاظت شده انجام می‌شود.

نتایج در صورتی که همانندسازی حفاظت شده بود

در شرایط حفاظت شده اگر آزمایش را با یک مولکول DNA نشانه‌دار شده با $$^{15}\text{N}$$ (مولکول سنگین) شروع کنیم، بعد از یک دور همانندسازی یک نسخه از مولکول اصلی (مولکول سنگین) و یک نسخه از مولکول سبک (نشانه‌دار شده با $$^{14}\text{N}$$) خواهیم داشت.

اگر این دو مولکول یک مرحله دیگر همانندسازی کنند، ۴ مولکول تولید خواهد شد که ۳ تا از آن‌ها مولکول‌های DNA سبک و یکی نیز DNA سنگین خواهد بود. با رفتن به مرحله سوم، شاهد حضور ۷ مولکول DNA سبک و ۱ مولکول DNA سنگی خواهیم بود.

این الگو که توصیف شد به ما نشان می‌دهد که تحت شرایط همانندسازی حفاظت شده، مولکول DNA سنگین هیچ‌وقت حذف نخواهد شد، فقط فراوانی آن با توجه به افزایش مولکول‌های DNA سبک، کاهش می‌یابد. همچنین در این روش هیچ‌گاه شاهد ساخت مولکول‌های DNA هیبرید نخواهیم بود. بنابراین این انتظاراتی که از همانندسازی حفاظت شده می‌رود با نتایج آزمایش مزلسون استال مغایر است و می‌توان نتیجه‌گیری کرد که همانندسازی DNA به صورت حفاظت شده رخ نمی‌دهد.

نتایج در صورتی که همانندسازی غیرحفاظتی بود

روش همانندسازی غیرحفاظتی DNA پیش‌بینی می‌کند که هر مولکول تازه سنتز شده، تلفیقی از DNA مادری (از نسل قبل) و DNA دختری (مولکول تازه سنتز شده در فرآیند همانندسازی) است. در این روش همانندسازی فرض بر این است که مولکول‌های قدیمی و جدید تکه‌تکه می‌شوند و سپس با یکدیگر جفت و متصل می‌شوند تا رشته مارپیچ DNA را تشکیل بدهند.

با توجه به این مجموعه اتفاقات می‌توان انتظار داشت که در هر دور از همانندسازی، مولکول‌هایی ساخته شوند که دارای قطعات هر دو DNA نیتروژن ۱۴ و ۱۵ هستند. با گذشت چند نسل، قطعات دارای $$^{14}\text{N}$$ بیشتر و بیشتر می‌شوند و به این ترتیب چگالی DNA به مرور زمان کم می‌شود. این شرایط به ما یک باند مشخص نخواهد داد و سایه روشنی از مولکول‌های DNA با چگالی متفاوت خواهیم دید. در آزمایش مزلسون استال چنین نتایجی گزارش نشد،‌ بنابراین نتیجه گرفتند که DNA به روش غیرحفاظتی تکثیر نمی‌شود.

خلاصه و جدول مراحل آزمایش مزلسون و استال

در این مطلب از مجله فرادرس به سراغ اثبات فرضیه واتسون و کریک راجع به همانندسازی DNA رفتیم. این دو دانشمند هنگام معرفی ساختار DNA فرضیه‌ای را معرفی کردند که با عنوان «همانندسازی نیمه‌محافظت شده DNA» شناخته می‌شود اما بعدها دو نظریه دیگر نیز برای همانندسازی مولکول دنا مطرح شد که به عنوان روش‌های «حفاظت شده» و «غیرحفاظتی» شناخته شدند.

دو دانشمند به نام‌ها «مزلسون» و «استال» طی یک آزمایش که با عنوان «آزمایش مزلسون استال» شناخته می‌شود، اثبات کردند که DNA به صورت نیمه‌حفاظت شده، همانندسازی می‌شود. در طی این آزمایش باکتری‌های اشرشیا کلای در دو محیط کشت متفاوت، تکثیر شدند.

1. محیط کشت $$^{15}\text{N}$$: حاوی ایزوتوپ سنگین $$^{15}\text{N}$$ بود که باعث می‌شد DNA سنتز شده با این ایزوتوپ نشانه‌دار شود.
2. محیط کشت $$^{14}\text{N}$$: حاوی نوع سبک نیتروژن یعنی $$^{14}\text{N}$$ بود که در مرحله دوم آزمایش مورد استفاده قرار گرفت ، سپس نسل به نسل باکتری‌ها از لحاظ توالی DNA بررسی شدند.

نتایج حاصل از کشت‌ باکتری‌ها در این دو محیط کشت متفاوت نشان دادند که بین این سه نظریه موجود، نظریه «نیمه‌حفاظت شده» در واقعیت رخ می‌دهد. در جدول زیر خلاصه‌ای از نتایج هر مرحله از آزمایش را ارائه داده‌ایم.