محیط کشت چیست؟ — هر آنچه باید بدانید

محیط کشت یا محیط رشد، مایعی یا ژلی است که به منظور رشد میکروارگانیسم‌ها، سلول‌ها و یا گیاهان کوچک طراحی می‌شود. محیط کشتِ سلولی به طور کلی منبع مناسبی از انرژی و ترکیباتی است که چرخه سلول را تنظیم می‌کنند. یک محیط کشت معمولی ترکیبات مختلفی از جمله آمینواسیدها، ویتامین‌ها، نمک‌های معدنی‌، گلوکز، سرم و هورمون‌ها را برای رشد ارگانیسم‌ها در خود دارد.

انواع محیط کشت

انواع سلول‌های جانوری، گیاهی و جلبک‌ها می‌توانند در محیط کشت‌های کاملا طبیعی و یا مصنوعی (سنتزی) رشد کنند. محیط کشتِ مورد استفاده، با توجه به نوع یاخته می‌تواند متفاوت باشد.

فیلم آموزش تکنیک های کشت سلول و اصول راه اندازی آزمایشگاه آن در فرادرس

کلیک کنید

محیط کشت طبیعی چیست؟

محیط کشت‌های طبیعی، مایعات بیولوژیکی هستند که برای رشد طیف وسیعی از سلول‌های جانوری بسیار مفید هستند. این محیط‌ها به علت مشخص نبودن ترکیبات تشکیل دهنده، قابلیت تولید مجدد ندارند و این یکی از معایب استفاده از آن‌ها در کشت سلول است. انواع محیط کشت‌های طبیعی شامل مایعات بیولوژیک، عصاره‌های بافتی و پلاسما هستند.

محیط کشت مصنوعی چیست؟

محیط کشت‌‌های مصنوعی (سنتزی) از ترکیب کردن مواد مغذی (مواد آلی و غیر‌آلی) شامل ویتامین‌ها، نمک‌ها، گازهای اکسیژن و کربن‌دی‌اکسید، پروتئین‌های سرم، کربوهیدرات‌ها و کوفاکتورها تشکیل می‌شوند. محیط کشت‌‌های مصنوعی مختلفی برای اهداف متفاوتی از جمله موارد زیر ساخته شده‌اند:

• زنده ماندن سلول‌ها در کوتاه‌مدت: یک محلول نمکی با pH و فشار اسمزی متعادل.
• زنده ماندن سلول‌ها در طولانی مدت: یک محلول نمکی متعادل با فرمولاسیون ترکیبات آلی و سرم.
• رشد و تکثیر سلول‌ها: این نوع از محیط کشت‌ها مواد مورد نیاز جهت افزایش تعداد سلول‌ها و تقسیم سلولی را در خود دارند.
• عملکرد‌های اختصاصی: در این محیطِ کشت‌ها مواد شیمیایی خاصی جهت تولید محصولات سلولی وجود دارند که این مواد ساخته‌ شده توسط ارگانیسم‌ها، پس از اتمام فرایند کشت قابل تخلیص هستند.

انواع محیط کشت مصنوعی

محیط کشت‌های مصنوعی به 4 دسته تقسیم می‌شوند:

• محیط کشت‌های حاوی سرم: سرم جنین گاوی یکی از رایج‌‌ترین مکمل‌ها در ساخت محیطِ کشت سلول‌های جانوری است که از آن به عنوان یک مکمل ارزان‌قیمت برای تولید محیط کشت بهینه استفاده می‌شود. سرم، حامل‌ها یا کِلاتورهایی را برای مواد مغذی محلول در آب، هورمون‌ها، فاکتورهای رشد، پروتئازها و مهارکننده‌ها  فراهم می‌کند و همچنین بخش‌های سمی موجود در محیط کشت را خنثی می‌کند.
• محیط کشت‌های فاقد سرم: وجود سرم در محیط کشت، ایرادات بسیاری دارد و می‌تواند منجر به تفسیر اشتباه در مطالعات ایمونولوژیک شود. تعدادی از محیطِ کشت‌‌های فاقد سرم وجود دارند که به طور خاص برای رشد تک سلولی‌ها فرموله شده‌اند.
• محیط کشت‌های شیمیایی خاص: محیط‌های کشت حاوی ترکیبات آلی و غیر آلی خالص و بدون آلودگی و گاهی فاکتورهای رشد هستند. مواد تشکیل دهنده آن‌ها با اضافه کردن ویتامین‌ها، کلسترول، آمینواسیدهای خاص و اسیدهای چرب در سلول‌های باکتریایی و مخمر با استفاده از مهندسی ژنتیک تولید می‌شوند.
• محیط کشت‌های فاقد پروتئین: محیطِ کشت‌های بدون پروتئین فاقد هرگونه ترکیب پروتئینی هستند. در مقایسه با محیط حاوی سرم، استفاده از محیط کشت‌های فاقد پروتئین باعث افزایش رشد سلول و افزایش بیان ژن می‌شود و فرایند تخلیص پروتئین‌های بیانی را تسهیل می‌کند.

انواع محیط کشت بر اساس حالت فیزیکی کدام‌ها هستند؟

محیطِ کشت‌ها بر اساس قوام و حالت فیزیکی آن‌ها به سه دسته‌ اصلی جامد، نیمه‌ جامد و مایع تقسیم می‌شوند که از آن‌ها به منظور کاربرد‌های ویژه‌ای از جمله شناسایی و تشخیص میکروارگانیسم‌ها، بررسی تغییرات سویه‌ها در محیط رشد، بررسی حرکت میکروارگانیسم و انجام تست‌های بیوشیمیایی در آزمایشگاه‌های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می‌شوند.

محیط کشت جامد

«محیط کشت جامد» (Solid Culture Media) برای شناسایی و تشخیص بسیاری از باکتری‌ها و پاتوژن‌ها به ‌کار‌‌ می‌رود. همچنین برای مشاهده و بررسی شکل ظاهری کلنی‌های باکتریایی و بررسی تغییرات در حین کشت از این نوع محیط استفاده می‌شود. این نوع از محیط‌ها معمولا حاوی ۱ تا ۲ درصد آگار هستند و عمدتا در ظروف پتری‌دیش ساخته می‌شوند. همچنین از آن‌ها برای انجام کشت عمیق در داخل لوله‌های آزمایش نیز استفاده می‌شود. مثال‌هایی از این مورد شامل نوترینت آگار و بلاد آگار هستند.

فیلم آموزش تکنیک های کشت سلول و اصول راه اندازی آزمایشگاه آن در فرادرس

کلیک کنید

محیط کشت نیمه جامد چیست؟

«محیط کشت نیمه جامد» (Semisolid Culture Media) با اضافه کردن ۰/۲ تا ۰/۵ درصد آگار به محیط مایع تهیه می‌شود و از آن عمدتا به عنوان محیط انتقالی و بررسی تحرک سویه استفاده می‌شود. به طور مثال «کَری‌بلیر» (Cary - Blair) یکی از انواع محیط‌های نیمه‌جامد است.

محیط کشت مایع

به «محیط کشت مایع» (Fluid Culture Media) آگار اضافه نمی‌شود و در تهیه محیط‌های غنی‌شده و انجام تست‌های بیوشیمی کاربرد دارد. میزان رشد باکتری‌ها در این نوع محیط رشد، از طریق بررسی کدورت محلول قابل مشاهده است.

انواع محیط کشت رایج در آزمایشگاه کدام‌ها هستند؟

محیطِ کشت‌ها بر اساس کاربرد آن‌ها در آزمایشگاه به انواع مختلفی تقسیم می‌شوند که از جمله این کاربرد‌ها می‌توان به رشد سلول، تکثیر ارگانیسم‌های خاص، تفکیک سلول‌های مختلف، انتقال نمونه‌ها و جلوگیری از آلودگی آن‌ها و همچنین نگه‌داری سلول‌ها در طولانی مدت اشاره کرد.

• «محیط کشت پایه» (Basal Media): برای رشد باکتری‌هایی مورد استفاده قرار می‌گیرد که نیازی به محیط‌های اختصاصی ندارند. به عنوان مثال می‌توان به «نوترینت براث» (Nutrient Broth)، «نوترینت آگار» (Nutrient Agar) و «پپتون واتر» (Peptone Water) اشاره کرد. استافیلوکوکوس و انتروباکترها در این محیط‌ها رشد می‌کنند.
• «محیط کشت غنی شده» (Enriched Media): این نوع از محیط‌ها مانند «بلاد آگار» (Blood Agar) معمولا با استفاده از خون یا سرم غنی می‌شوند و برای رشد و تکثیر میکروارگانیسم‌های خاصی به کار می‌روند. استرپتوکوکی در این نوع محیط رشد می‌کند.

فیلم آموزش تکنیک های کشت سلول و اصول راه اندازی آزمایشگاه آن

کلیک کنید

• «محیط کشت انتخابی» (Selective Media): این نوع از محیط کشت‌ها با مهار رشد سایر باکتری‌ها، رشد یک سویه خاص باکتری را تسهیل می‌کنند. به این محیط‌ها می‌توان آنتی‌بیوتیک اضافه کرد. مثال‌هایی از محیط کشتِ انتخابی، «مک‌کانگی آگار» (MacConkey Agar) و «محیط تلوریت» (Tellurite Media) هستند. محیط تلوریت رشد تمامی باکتری‌های حفره گلو را به جز باسیل دیفتری مهار می‌کند.
• «محیط کشت افتراقی» (Differential Media): از این محیط برای تمایز و تفکیک سلول‌ها به هنگام رشد استفاده می‌شود. محیط EMB یک نوع محیط افتراقی است.
• «محیط کشت انتقالی» (Transport Media): از آن برای انتقال و جابجایی سویه مورد نظر استفاده می‌شود و رشد و تکثیر ارگانیسم‌ها در آن صورت نمی‌گیرد. چنین محیط‌هایی برای جلوگیری از خشک شدن نمونه‌ها و انتقال راحت‌تر آن‌ها به آزمایشگاه استفاده می‌شوند. مثال‌هایی از این محیط کشت، «کَری‌بلیر» (Cary - Blair) و «امیس» (Amies) هستند.
• «محیط کشت ذخیره کننده» (Storage Media): این نوع محیطِ کشت، برای ذخیره و نگه‌داری باکتری‌ها برای مدت طولانی مورد استفاده قرار می‌گیرد، مثل محیط «اِگ‌سالین» (Egg Saline).

ترکیبات اصلی محیط کشت چه هستند؟

محیط کشت شامل مخلوطی از آمینواسیدها، گلوکز، نمک‌ها، ویتامین‌ها و سایر مواد مغذی و در دسترس است که می‌توان آن‌ها را به صورت پودر یا به صورت مایع از شرکت‌های تولیدکننده تهیه کرد. مواد و اجزای مورد نیاز در ترکیبات محیط رشد بسته به نوع سلول متفاوت هستند و این تفاوت‌ها باعث ایجاد فرمولاسیون‌های جدید در محیط‌های کشت می‌شوند. هر ترکیب موجود در محیط کشت نقش خاصی را به عهده دارد که در زیر به تفصیل شرح داده شده‌اند.

سیستم‌ های بافری

تنظیم pH نقش مهمی در ایجاد شرایط بهینه رشد سلول به عهده دارد که به نوبه خود توسط یکی از ۲ سیستم بافری زیر که در ادامه توضیح داده شده‌اند صورت می‌گیرد.

سیستم بافری طبیعی

در یک سیستم بافری طبیعی، گاز کربن دی‌اکسید از طریق ترکیبات کربنات موجود در محیطِ کشت، اسیدیته محیط را تنظیم می‌کند. محیط کشت‌های دارای سیستم بافری طبیعی، لازم است تا در اتمسفر حاوی ۵ تا ۱۰ درصد کربن دی‌اکسید انکوبه شوند. یک سیستم بافری طبیعی، ارزان قیمت و غیر سمی است.

HEPES

HEPES سیستم بافری شیمیایی دارای زویتریون است که ظرفیت بافری بالایی در حدود ۷/۲ تا ۷/۴ دارد و نیازی به گازهای کنترل‌ کننده اتمسفر نیست. HEPES گران قیمت بوده و غلظت بالای آن برای برخی از انواع سلول‌ها سمی است. HEPES همچنین حساسیت محیط را به اثرات سمی ناشی از قرارگرفتن در معرض نور فلورسنت بسیار افزایش می‌دهد.

فنول‌ رد

بسیاری از محیطِ کشت‌های تجاری در دسترس حاوی فنول رد هستند که به عنوان نشانگر عمل می‌کنند و نظارت بر تنظیم pH را انجام می‌دهند. در طول رشد سلول، رنگ محیط کشت با توجه به متابولیت‌های آزاد شده توسط سلول‌ها تغییر می‌کند. فنول رد در pHهای پایین، رنگ محیط را به زرد و در سطوح بالای pH، رنگ محیط را به بنفش تغییر می‌دهد. محیط کشت در شرایط بهینه رشد سلول (pH= ۷/۲)، قرمز روشن است.

استفاده از فنول ‌رد دارای معایبی از جمله موارد زیر است:

• فنول رد عملکرد برخی از هورمون‌های استروئیدی مثل استروژن را تقلید می‌کند، به همین دلیل بهتر است در مطالعات بالینی که سلول‌های حساس به استروژن مثل بافت پستان به کار رفته‌اند از محیط‌های بدون فنول رد استفاده شود.
• وجود فنول رد در برخی از فرمولاسیون‌های فاقد سرم با هموئوستاز سدیم - پتاسیم تداخل ایجاد می‌کند که این اثر را می‌توان با قراردادن سرم یا هورمون هیپوفیز گاوی در محیط خنثی کرد.
• فنول رد در مطالعات فلوسایتومتری تداخل ایجاد می‌کند.

نمک ‌های غیر آلی

نمک‌های غیرآلی موجود در محیطِ کشت با تأمین یون‌های سدیم، پتاسیم و کلسیم به حفظ تعادل اسمزی و تنظیم پتانسیل غشای سلول کمک می‌کنند. سلول‌ها در حین رشد و تکثیر خود نیاز به برقراری ارتباط با یکدیگر دارند که این مهم از طریق حفظ پتانسیل اسمزی و ارتباطات غشایی بین سلول‌ها برقرار می‌شود.

آمینو اسید ها

آمینواسیدها بلوک‌های ساختمانی پروتئین‌ها هستند، بنابراین در همه محیط کشت‌های شناخته شده وجود دارند. آمینواسید‌های ضروری باید در محیطِ کشت وجود داشته باشند زیرا سلول به تنهایی قادر به ساخت آن‌ها نیست و در مراحل رشد و تکثیر خود به انواع آمینواسیدها نیاز دارد که برخی از آن‌ها توسط خود سلول تولید می‌شوند و برخی دیگر را از طریق محیط کشت دریافت می‌کند.

کربوهیدرات ‌ها

کربوهیدرات‌ها یا قندها منبع اصلی تامین انرژی سلول هستند. بسیاری از محیط‌های کشت گلوکز و گالاکتوز دارند در حالی که برخی دیگر از آن‌ها حاوی مالتوز و فروکتوز هستند. با توجه به رده سلولی و توانایی سلول در استفاده از قندها به عنوان منبع تامین انرژی، نوع کربوهیدرات مورد نظر جهت اضافه کردن به محیط کشت انتخاب می‌شود.

پروتئین ‌ها و پپتیدها

رایج‌‌ترین پروتئین‌ها و پپتید‌های مورد استفاده در محیط‌های کشت، آلبومین، ترنسفرین و فیبرونکتین هستند که اهمیت خاصی در محیط کشت‌های فاقد سرم دارند. آلبومین، پروتئین اصلی خون است که در انتقال آب، نمک‌ها، اسیدهای چرب آزاد، هورمون‌ها و ویتامین‌ها و انتقال آن‌ها بین بافت‌ها نقش دارد. ظرفیت اتصالی آلبومین، آن را برای حذف ترکیبات سمی از سلول و محیط کشت مناسب کرده است.

اسید های چرب و لیپید ها

اضافه کردن این ترکیبات به طور خاص در محیط کشت‌های فاقد سرم اهمیت ویژه‌ای دارد، زیرا معمولا در داخل سرم وجود دارند، به همین دلیل در محیطِ کشت‌های حاوی سرم نیاز سلول به اسیدهای چرب و لیپیدها جهت رشد و تکثیر برآورده می‌شود اما در محیط‌های کشت فاقد سرم باید طی مراحل تهیه و آماده‌سازی، به محیطِ کشت اضافه شوند.

ویتامین‌ ها

بسیاری از ویتامین‌ها برای رشد و افزایش تعداد سلول‌ها ضروری هستند. ویتامین‌ها به مقدار مورد نیاز توسط سلول سنتز نمی‌شوند، بنابراین مکمل‌های مهم مورد نیاز و ضروری در کشت سلول و کشت بافت هستند. غالبا ویتامین‌های محلول در چربی در داخل محیط‌های حاوی سرم وجود دارند اما  سایر ویتامین‌ها در هنگام آماده‌سازی باید به محیطِ کشت اضافه شوند.

عناصر کمیاب

«عناصر کمیاب» (Trace Elements) غالباً به محیط‌های فاقد سرم اضافه می‌شوند تا جایگزینی برای عناصر موجود در سرم باشند. عناصر کمیاب مثل روی، مس، سلنیوم و تری کربوکسیلیک اسید، عناصر شیمیایی هستند که به مقدار کم برای رشد سلول مورد نیاز هستند. این ریزمغذی‌ها برای بسیاری از فرایندهای بیولوژیکی از جمله تولید آنزیم‌ها ضرورت دارند.

مکمل ‌های محیط کشت

محیط رشد کامل که برای برخی از رده‌های سلولی توصیه شده‌ است، به اجزای اضافی نیاز دارد که در محیط رشد پایه و سرم وجود ندارند. این ترکیبات و مکمل‌ها به حفظ تکثیر و متابولیسم سلول کمک می‌کنند. اگرچه ترکیباتی مثل هورمون‌ها، فاکتورهای رشد و انتقال‌دهنده‌ها برای رشد رده‌های سلولی مختلف مورد نیاز هستند، اما همیشه برای اضافه کردن آن‌ها لازم است اقدامات احتیاطی صورت بگیرد.

اضافه کردن مکمل‌ها به محیط کشت، می‌تواند اسمولالیته (غلظت املاح در ۱۰۰۰ گرم آب) محیطِ کشت را تغییر دهد که این می‌تواند باعث تاثیر منفی در رشد سلول‌ها شود. بنابراین بهتر است بعد از اضافه کردن مکمل‌ها اسمولالیته محیط دوباره تنظیم شود. عمر مفید محیط کشت بعد از اضافه کردن مکمل‌ها کوتاه خواهد شد. محیط کشت‌های حاوی پروتئین سریع‌تر از محیط‌های پایه تخریب می‌شوند.

آنتی‌ بیوتیک‌ ها

اگرچه این ترکیبات برای رشد سلول ضروری نیستند اما گاهی برای کنترل آلودگی‌های باکتریایی و قارچی مورد نیاز هستند. استفاده مداوم از آنتی‌بیوتیک‌ها توصیه نمی‌شود، زیرا ممکن است باعث پنهان شدن آلودگی‌های ایجاد شده توسط مایکوپلاسما و باکتری‌های مقاوم شوند. همچنین آنتی‌بیوتیک‌ها ممکن است در متابولیسم سلول‌های حساس تداخل ایجاد کنند.

سرم در محیط کشت چه نقشی دارد؟

سرم ترکیب مختلفی از آلبومین‌ها، فاکتورهای رشد و مهارکننده‌های رشد است. سرم یکی از مهم‌ترین ترکیبات محیطِ کشت سلول است که به عنوان منبع مناسبی از آمینواسیدها، پروتئین‌ها، ویتامین‌ها (خصوصا ویتامین‌های محلول در چربی مثل ویتامین‌های A، D، E، K)، کربوهیدرات‌ها، لیپید‌ها، هورمون‌ها، فاکتورهای رشد، مواد معدنی و عناصر کمیاب در نظر گرفته می‌شود.

سرم‌های گاوی موجب رشد مناسب سلول‌ها در محیط کشت هستند. محیط کشتِ نرمال اغلب شامل ۲ تا ۱۰ درصد سرم است. اضافه کردن سرم به محیط کشت مزایای زیر را به دنبال دارد:

• سرم مواد مغذی اساسی (محلول و غیرمحلول) برای رشد سلول‌ها را فراهم می‌کند.
• سرم دارای فاکتورهای رشد و هورمون‌های مختلف درگیر در ارتقای رشد سلول و عملکرد بهتر سلول است.
• با تأمین پروتئین‌های اتصال‌دهنده مثل آلبومین و ترنسفرین، زمینه انتقال سایر مولکول‌ها به سلول فراهم می‌شود (آلبومین لیپیدها، ویتامین‌ها و هورمون‌ها را به داخل سلول حمل می‌کند).
• سرم حاوی فیبرونکتین است که باعث اتصال سلول به سوبسترا می‌شود، همچنین دارای پروتئین‌های جداکننده‌ای است که به سلول‌ها کمک می‌کنند که در تقسیمات سلولی به راحتی از هم جدا شوند.
• سرم حاوی پروتئازهای سلولی است که از آن در مقابل پروتئولیز محافظت می‌کنند.
• سرم دارای مواد معدنی ارزشمندی شامل یون‌های سدیم، پتاسیم، روی و آهن است.
• سرم با افزایش ویسکوزیته محیط کشت، باعث حفاظت از سلول‌ها از آسیب‌های مکانیکی هنگام هوادهی می‌شود.

در جدول زیر مزایا و معایب استفاده از سرم در محیط کشت، به تفکیک بررسی شده‌اند.

انواع محیط کشت قابل تهیه کدام‌ ها هستند؟

محیط‌های کشت به ۳ حالت از شرکت‌های تجاری قابل تهیه است:

• شکل پودری: به صورت خشک خریداری می‌شود و برای استفاده نیاز به اضافه کردن آب یا حلال‌های دیگر و آماده سازی و استریل کردن دارد.
• شکل غلیظ: مواد مورد نیاز رشد ارگانیسم در آن به صورت کامل وجود دارند و برای استفاده در کشت نیاز به رقیق شدن دارد.
• شکل آماده: برای استفاده آماده است و نیازی به آماده‌سازی و تغییر و یا استریل شدن نیست.